In-Cell Western（ICW）是由美国LI-COR公司开发的一种在微孔板中进行的定量免疫荧光(IF)测定方法。它结合了蛋白质印迹的特异性和ELISA的可复制性和通量，为Western Blot提供了一种方便的替代方法。
01
操作流程
细胞培养：将细胞接种于黑壁透明底的96/384孔板
刺激/抑制处理
细胞固定和透化：① 3.7%甲醛固定+0.1% Triton X-100透化处理，适用于大部分实验流程；② 使用甲醇进行固定透化，适用于结构蛋白或位于细胞核内的蛋白。
封闭：加入封闭液，室温震荡1.5 h。
一抗孵育：室温下震荡2h或者4度过夜。
清洗：1XPBS+0.1% Tween 20 室温下震荡5min，共洗5次。
二抗孵育：加入稀释好的近红外荧光二抗，室温震荡1 h。
成像：去除孔里buffer，正置放到Odyssey仪器上立即检测；也可以4℃保存数周。
Tips：
①推荐使用黑边底透的96/384孔板，避免信号干扰（Agilent #204626-100，#204628-100）；
②推荐使用IF一抗（CST提供超过1000种可以用于ICW测定法的抗体）；
③建议用封闭液取代一抗，设置阴性对照孔；
④建议每个样品设置3个重复；
⑤当目标蛋白位于细胞表面时，不需要做透化处理（On-Cell Western）;
⑥悬浮细胞需提前进行贴壁处理：使用无血清的培养基培养，10 min后细胞沉淀，在孔板上形成单层细胞。
02
解决方案
CellTag™ Stain
和Western Blot一样，在ICW检测中，需要用到均一化方法校正各孔之间细胞数量的微小差异。
使用内部control蛋白进行均一化：
① 看家蛋白：如Actin、Tubulin、GAPDH等；
② 磷酸化总蛋白：磷酸化试验
您可以使用宿主物种或亚类/同种型不同的一抗，使用标记有不同IRDye荧光团的二抗进行双色成像。
But
使用内部control蛋白进行均一化时，其水平稳定应不受实验条件影响。一个可靠的内部control蛋白所产生的信号应该与孔中的细胞数成正比。但是这种均一化并不能校正人员操作等原因引起的误差，因此LI-COR建议使用细胞染色剂作为均一化的方法。
LI-COR提供CellTag 700 Stain（#926-41090）和CellTag 520 Stain（#926-41094）作为ICW Assay均一化的解决方案。CellTag染色剂在透化细胞的细胞核和细胞质中积累，并在各种细胞类型和细胞数量中提供线性荧光信号。这种方法既快速又简单，同时可以与二抗孵育相结合。
将不同数量的A431和NIH/3T3细胞接种在96孔板中。细胞被固定、透化、用CellTag 700 Stain (0.2 μM)染色，并用Odyssey Classic红外成像系统检测。
封闭液
封闭是基于细胞的测定方案中的重要步骤。封闭液可以结合孔中未被细胞占据的空间并结合细胞中潜在的非特异性结合位点，通过降低背景、提高信噪比和促进一抗的特异性结合的同时最大限度地减少非特异性相互作用来提高灵敏度。
LI-COR提供多种用于Odyssey成像系统的封闭缓冲液。Intercept基于非哺乳动物蛋白的封闭缓冲液（#927-60001,927-70001）经过优化，可与IRDye®产品和其他近红外荧光团配合使用。它们为定量蛋白质印迹和其他免疫测定提供出色的性能、低变异性和低背景。
Western blot方法比较了Intercept封闭缓冲液和Odyssey封闭缓冲液。用小鼠心脏组织提取液系列稀释后的blot检测Stat3 mouse mAb和p38 MAPK Rabbit Ab，用IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG和IRDye 680LT山羊抗兔IgG检测，并在Odyssey CLx成像系统上一起扫描。
Intercept封闭缓冲液可用于稀释HRP偶联的二抗，并可用于在将印迹与HRP偶联的二抗孵育之前的封闭步骤。由于Intercept封闭缓冲液不含叠氮化钠，因此它们也可以为化学发光蛋白质印迹检测提供同样出色的性能。
IRDye近红外荧光二抗
二抗的质量和性能对Western Blot，ICW检测以及许多其他免疫反应至关重要。IRDye系列近红外荧光染料已针对Odyssey ®系列成像系统进行了优化，具有亮度高、光稳定性好等特点。此外IRDye系列近红外荧光染料发射光谱窄，预先经过高交联吸附处理，具有极高的信噪比，交叉反应已降到最低，使其适用于多色检测。
IRDye近红外荧光二抗选择指南
Empiria Studio软件
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