核酸电泳常见问题分析及解决方案

核酸电泳是一种核酸分离、鉴定和纯化的常用方法，广泛应用于分子生物学应用领域。一旦核酸电泳过程中遇到问题，那么就可能会影响下游实验进度，最终降低实验工作效率。为了让大家的实验顺利完成，小编整理了一些关于核酸凝胶电泳的常见问题，帮助大家排忧解难。

上样量不足

尝试增加上样量。

核酸降解

在核酸提取和电泳过程中，使用分子生物学等级试剂，切勿使用含核酸酶的耗材，避免核酸酶污染。

电泳缓冲液使用不当  

TAE缓冲液短期内更适用于分离大片段，长时间运行易产热；TBE缓冲液对于更短片段更好，适用于长时间运行而不易导致过热，但可能会减缓线性dsDNA的迁移。

DNA跑出凝胶 

DNA小片段分子量较小，迁移速率快，容易跑出凝胶。可以适当减少电泳时间、降低电压或使用溴酚蓝等示踪剂来标识条带，避免跑出凝胶。

电极反接  

确保将电极正确连接至电源，放置凝胶时，凝胶孔应与负极位于同侧。

正极 --- 红色 ，负极 --- 黑色

光源错误  

如果使用荧光染料进行染色，请检查其激发波长以确保使用的光源合适。EB染料使用紫外光源，安全染料如SYBR Green、Gelstar、GeneFinder使用波长400-500nm的蓝绿可见光检测。

核酸降解 

在核酸提取和电泳过程中，避免核酸酶污染。

核酸纯度差，样品含大量蛋白质或盐

纯化样品去除盐和蛋白质，或使用SDS-filled loading dye制备样品。

电泳条件不合适  

电泳时选择合适的电泳缓冲液并需要经常更换，根据需要分离的核酸片段大小调整电压。

核酸电泳运行电压 (V) = 电极间的距离 (cm) x 5-10 V/cm。

上样孔形成不佳  

可在制胶前清洁制胶梳，胶不宜太厚，凝胶凝固后小心移除凝胶梳，防止损坏上样孔。

上样量过大 

上样量过大，易出现拖尾、弯曲或U形条带以及融合条带。

凝胶孔中有气泡  

上样时避免有气泡滞留在孔内，否则容易出现条带变形。

电泳条件不合适 

根据核酸片段大小使用合适的电压和电泳缓冲液。同时注意电泳时间过长会导致过度加热、样品变性和条带扩散。

电压对DNA电泳的影响

左图，高电压导致的微笑型条带；右图，电压合适条件下的正常电泳条带。

琼脂糖凝胶浓度使用不当 

不同分子量大小的核酸片段都有其适合的琼脂糖浓度，如果琼脂糖浓度使用不当，可能导致目的条带分离不佳。

上表展示了不同浓度琼脂糖凝胶所对应的线性DNA合适的分辨范围，可根据核酸片段大小选择合适的琼脂糖浓度以取得较好的分离效果。

BIOWEST琼脂糖

不含核酸酶，具有高强度、低背景等优点。

琼脂糖凝胶制备不当  

使用与电泳缓冲液相同的缓冲液溶解琼脂糖，煮沸琼脂糖凝胶后，不应剩余任何未溶解粉末或未融化固体。 

凝胶不平整或上样孔倾斜 

将凝胶槽放在平坦表面上，灌注凝胶并插入梳子。凝胶梳应完全垂直插入凝胶表面，与凝胶上边缘平行，并在凝胶凝固过程中保持稳固。

核酸降解或形成蛋白-核酸复合物 

可重新制备样品，或使用含SDS的上样缓冲液并加热样品，破坏蛋白质和核酸之间的相互作用。

含有相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同迁移率  

质粒DNA的不同构象 (如超螺旋、线性、松弛/开口) 在电泳中显示出不同的迁移率，需提前判断DNA是否有特殊结构。

带切口质粒是一个松弛、开放的环状构象，体积大，凝胶中迁移缓慢；线性质粒迁移速度稍快；完好无损的质粒最紧凑，迁移速度最快。

此外，富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢。