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qPCR实验不用慌,NanoDrop帮你忙!

qPCR实验不用慌,NanoDrop帮你忙! 基因快讯
2024-03-06
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导读:NanoDrop One/OneC超微量紫外分光光度计可以应用于qPCR/RT-qPCR的核酸质控中,其中的Acclaro™智能样本检测技术能够检测存在于DNA样本中的RNA污染或RNA样本中的DNA

NanoDrop One/OneC


由于荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR/qPCR)实验操作简单,检测速度快,灵敏性高和特异性好等特点,qPCR已成为核酸定量实验的金标准。在进行qPCR实验时,核酸样本必须以特定的浓度加入,并且要求其中没有污染物质,然而传统的分光光度计不能识别在260 nm波长下与目标样品共吸收的污染物,如RNA样品中的DNA污染。这一缺点导致实验人员高估样本浓度,进而影响qPCR或RT-qPCR结果。

NanoDrop One/OneC超微量紫外分光光度计可以应用于qPCR/RT-qPCR的核酸质控中,其中的Acclaro™智能样本检测技术能够检测存在于DNA样本中的RNA污染或RNA样本中的DNA污染。

污染物鉴定界面

图1:Acclaro智能样本检测技术鉴定的DNA污染的RNA光谱,以及校正的RNA浓度和光谱(黄色)


图2所示为dsDNA和RNA应用AcclaroTM智能样本检测技术可以识别的污染物。

图2:可以识别的dsDNA和RNA中的污染物


接下来我们一起看下它在qPCR实验前

质控的实际表现吧!


提取人淋巴细胞的总RNA和基因组DNA,在100 ng/µL RNA样本中掺入25 ng/µL的gDNA。提取人肿瘤细胞基因组DNA,100 ng/µL gDNA样本中掺入50 ng/µL的RNA。

在NanoDrop One/OneC仪器上测量添加了污染物的RNA和gDNA样本,确定AcclaroTM智能样本检测技术报告的校正浓度和原始浓度(图3)。随后将原始浓度和校正后的浓度稀释到25 ng/µL,然后加载到qPCR仪器上进行RT-qPCR和qPCR实验。


图3:在NanoDrop One/Onec上测量添加污染物的核酸样品的浓度以及校正后浓度

Part 01.

一、RT-qPCR实验

图4显示当RNA中掺入gDNA时对Cq值的影响。与对照组相比,不管模板使用校正浓度还是原始浓度构建的两组PCR体系,其Cq值均升高。使用校正浓度构建的PCR体系,其Cq值仍然高于对照组,因为样品中仍然存在gDNA污染。

AcclaroTM智能样本检测技术可以鉴定RNA样本中DNA污染,但结果表明,必须在RT-qPCR之前对RNA进行纯化,以提高准确性和重复性。


图4:RNA中的DNA污染对Cq值的影响


Part 02.

二、qPCR实验

图5显示当DNA中掺入RNA时对Cq值的影响。与对照组相比,不管模板使用校正浓度还是原始浓度构建的两组PCR体系,其Cq值均有误差。使用校正浓度构建的PCR体系,其Cq值低于对照组,因为样品中仍然存在RNA污染。

Acclaro智能样本检测技术可以鉴定DNA样本中RNA污染,但结果表明,必须在qPCR之前对DNA进行纯化,以提高实验的准确性和重复性。

图5:DNA中的RNA污染对Cq值的影响



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