蛋白免疫印迹（Western Blot，WB），实验人破防系列实验之一。
| 可能原因 | 方案建议 |
| “三明治”装置中膜顺序或装置在转膜槽中方向放反 | 检查“三明治”结构是否正确，并确认安装方向是否正确 |
| 电极插反 | 检查电极安装方向是否正确 |
| 转膜液不适配 | 确认转膜液和胶的适配性 |
| 膜未活化 | 用甲醇等充分激活膜 |
可能原因
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方案建议
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凝胶、膜和滤纸间存在气泡
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制作“三明治”结构时注意去除气泡，并确认“三明治”结构松紧合适
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转膜条件不合适（电压/电流、时间）
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可使用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流
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转膜缓冲液pH值与靶蛋白等电点接近
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调整缓冲液至合适的pH值
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转膜缓冲液缓冲能力降低，电流异常，效率降低
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及时更换新的转膜缓冲液
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膜未充分活化
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确保膜充分活化
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靶蛋白分子量小于10 kDa
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需要选择小孔径的膜，缩短转移时间
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甲醇浓度过高导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移
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降低甲醇浓度
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湿转过程环境温度过高
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借助冰袋等对转膜过程进行降温
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转膜槽黑色面铂金丝容易沉积结晶，沉淀过多造成实际电流无法达到预设值
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定期对转膜槽的黑色面铂金丝进行清理，避免结晶的沉积
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转膜滤纸过于陈旧，或不平整
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使用新的转膜滤纸
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上端无蛋白样品，转膜缓冲液未完全没过转膜“三明治”
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转膜时添加足量的转膜缓冲液，保证完全没过“三明治”结构
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Tips:当湿转过程温度过高时，还可能导致膜上出现大量斑点情况（如下图），这是由于温度高，膜干的快，可拿出后立即置于甲醇中等斑点消失后进行后续实验。
| 可能原因 | 方案建议 |
| 当按照“阴极-海棉-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-阳极”顺序依次放好后，两块板间未能压紧，导致凝胶和膜之间可能存在间隙，转膜时蛋白从空隙中流走 | 可通过更换夹板或夹板间适当增加滤纸解决 |
| 转膜时热量过高造成Marker变形，蛋白弥散 | 转膜过程中通过冰水浴等措施中和产生的热量 |
| 电源电压或电流不稳定 | 更换新的电泳仪电源 |
04
| 可能原因 | 方案建议 |
| 膜老化或者损坏，电流作用产生局部高温区，膜片烧焦 | 更换新的膜 |
| 电极接触不良导致电流在转膜过程中分布不均匀，局部电流密度过高，引起膜片局部烧焦 | 维修电极或者更换新的电极 |
05
| 可能原因 | 方案建议 |
| 膜污染 | 操作过程中保持膜整洁，不要用手按压膜的任何部位 |
| 膜未正确润湿 | 确认膜完全均匀润湿 |
| 膜种类选择不当，硝酸纤维素膜比PVDF膜背景低 | 更换适配的膜 |
06
| 可能原因 | 方案建议 |
| 碎胶粘附到膜上 | 及时去除碎胶，避免粘附现象的出现 |
| 缓冲液污染 | 更换新的转膜缓冲液 |
07
| 现象 | 可能原因 |
方案建议 |
| 条带上有多个白色小点 | 转膜过程中膜和胶间存在气泡 | 注意转膜前一定要将“三明治”内部气泡赶尽 |
| 目的位置上方的非特异杂带强度高，数量多 | 转膜强度过强 | 应适当降低转膜强度（时间和电流），使目标蛋白上方的蛋白少转移至膜上 |
| 泳道部分弯曲 | 可能是电泳槽问题，转膜时胶发生胶乱（8%以下的分离胶）被扭曲 | 更换新的电泳槽 |
结语
