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TRIzol 法提取 RNA 全流程详解

TRIzol 法提取 RNA 全流程详解 山西方特优生物科技有限公司
2025-06-07
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导读：TRIzol 法是实验室中常用的总 RNA 提取方法，利用 TRIzol 试剂（含苯酚、异硫氰酸胍等）裂解细胞并抑制 RNA 酶（RNase）活性，通过分层、沉淀和洗涤获得高纯度 RNA。
TRIzol 法是实验室中常用的总 RNA 提取方法，利用 TRIzol 试剂（含苯酚、异硫氰酸胍等）裂解细胞并抑制 RNA 酶（RNase）活性，通过分层、沉淀和洗涤获得高纯度 RNA。其原理基于试剂成分协同作用：
  • 苯酚：通过裂解细胞，实现蛋白质与核酸的分离，并同时抑制RNase的活性。
  • 异硫氰酸胍：破坏细胞结构，解聚核蛋白复合体，释放RNA，并通过强变性作用抑制 RNase。
  • 氯仿抽提：离心后溶液分层，RNA 溶于上层水相，DNA 和蛋白质分别进入中间层和有机相，实现分离。
  • 异丙醇沉淀：通过降低RNA 溶解度，使其从水相中析出。
  • 乙醇洗涤：去除盐离子和有机试剂残留，最终获得高纯度RNA。
实验前准备
1、试剂与耗材

  • TRIzol 试剂：请在室温下保存，并尽量避免频繁的冻融过程。

  • 氯仿、异丙醇、以及75% 乙醇（使用 DEPC 水配制，并在-20℃下预冷）。

  •  DEPC 水：经过0.1% DEPC 处理后进行高压灭菌，或者直接使用市面上销售的无 RNA 酶水。

  •  耗材：使用无 RNA 酶的离心管（1.5/2ml）、枪头、以及经过 DEPC 水处理或高温灭菌的研钵。


2、环境与防护
实验台面应使用75%的乙醇进行擦拭，佩戴一次性手套和口罩，以防止RNase污染（因为人体皮肤和唾液中含有RNase）。
样本应保持新鲜或及时进行保存处理（组织样本可采用液氮速冻后在-80℃条件下保存，细胞样本则需用胰酶消化后离心去除上清液，随后将沉淀物直接加入TRIzol中）。


操作步骤（以动物组织/细胞为例）
1、样本裂解
动物组织：取50-100 mg 的组织样本（例如肝脏或肌肉），放置于预冷的研钵内，加入适量液氮后充分研磨至粉末状。随后，将粉末转移到含有 1 ml TRIzol 的离心管中，通过剧烈涡旋或使用匀浆器进行彻底匀浆，直至液体变得澄清且无颗粒。
贴壁细胞：直接向每个孔（约含有5×10^6 个细胞）的 6 孔板中加入 1 ml TRIzol，使用枪头轻轻吹打直至细胞完全从板底脱落，然后将混合物转移到离心管中。
悬浮细胞：离心收集细胞（1000 rpm，5 分钟），弃去上清液，直接加入 1 ml TRIzol 重悬，反复吹打以裂解细胞。
关键：样本与 TRIzol 体积比需严格控制（一般 1:10，如 100 mg 组织加 1 ml TRIzol），避免 TRIzol 不足导致 RNA 降解。
2、分成与RNA分离
加入200 μl 氯仿，轻轻振荡 30 秒，然后在室温下静置 2-3 分钟，直至溶液呈现乳白色浑浊状态。
在4℃条件下进行离心操作（12,000 g，持续20分钟），离心后样本会分成三层：
  • 最上层为无色的水相层，其中含有RNA（大约占总体积的50%）。
  • 中间层呈现白色，主要由变性蛋白和DNA组成。
  • 最下层为红色的有机相，包含酚-氯仿和脂质成分。
在操作过程中，需谨慎吸取上层水相至新的离心管中（务必避免接触中间层，以防止DNA污染）。可以保留大约400 μl的水相（如果需要提取DNA，则可以保留剩余的液体）。
3、RNA沉淀
加入约600 μl异丙醇，轻轻颠倒混匀后，室温静置10分钟。
随后在4℃条件下进行离心（12,000 g，持续10分钟），管底可见胶状或白色RNA沉淀。
4、RNA洗涤
弃去上清液，加入 1 ml 预冷的 75% 乙醇，轻轻颠倒管身以洗涤沉淀物（注意避免剧烈吹打，以免沉淀物丢失）。
在 4℃条件下进行离心操作（7,500 g，持续 5 分钟），然后小心弃去乙醇，用移液器吸去残留的液体。
在室温下让沉淀物自然干燥 5-10 分钟（注意不要过度干燥，以免 RNA 难以溶解）。
5、RNA溶解
加入30-50 μl的DEPC水或无RNA酶水，使用枪头轻轻吹打以促进溶解，随后在55-60℃下温育5分钟以进一步促进溶解。
溶解后应立即使用，或存储于-80℃的环境中以长期保存（短期保存可置于-20℃，但应避免反复冻融）。
质量检测
1、浓度与纯度测定
取 1-2 μl RNA 溶液，利用分光光度计测定其 OD 值：
OD260/280：纯度良好的 RNA 应呈现 1.8-2.0 的比值（若低于 1.8 可能表明存在蛋白质污染，而高于 2.0 则可能暗示降解或盐类污染）。
OD260/230：此值应大于 2.0（若低于此值，则可能表明有酚、盐或异丙醇残留）。
2、完整性检测
通过琼脂糖凝胶电泳（使用 1.2% 的凝胶，可选择含甲醛或普通凝胶）：
真核生物的 RNA 应展示出清晰的 28S 和 18S 核糖体 RNA 条带，其亮度比大约为 2:1，而 5S 条带相对较弱。
若条带出现模糊或弥散现象，则表明 RNA 可能已经降解，需要重新提取。
注意事项
1、RNase 污染控制
所有耗材需无 RNA 酶（可购买商品化产品或用 0.1% DEPC 水处理后灭菌）。
避免用手直接接触耗材，操作中及时更换手套。
2、样本处理要点
组织研磨需彻底，避免未裂解的细胞残留导致 RNA 得率低。
血液样本需用抗凝剂（如 EDTA），避免使用肝素（抑制逆转录酶）。
3、常见问题与解决方法
RNA 降解：样本裂解不充分、操作时间过长、RNase 污染，或未及时低温保存。
纯度低（OD260/280 低）：吸取水相时混入中间层，可重复氯仿抽提一次。
沉淀丢失：在洗涤过程中应轻柔操作，离心后应沿着管壁缓慢倾倒弃液。
其他样本类型调整
植物组织：含多糖 / 多酚，可在裂解后加氯仿前，先加 0.2 体积的 5M NaCl，离心后取上清再继续操作。
细菌 / 酵母：需先经溶菌酶或玻璃珠破壁，再按常规步骤提取。
本文转载自 生物奇迹biomiracle 衷心感谢本篇文章的原创者，让知识得以广泛传播。谢谢您的付出！

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