qPCR引物设计的好坏直接决定了定量结果的可靠性。设计定量引物的方式有很多种，比如NCBI，Primer或者Oligo软件等；NCBI受限于网络，oligo和primer软件等不支持批量设计和引物特异性检测。大多数情况下，我们一次需要设计多个基因的qPCR引物。今天为大家介绍一种高效地批量设计qPCR引物并检测引物特异性的方法。
准备工作
1.TBtools下载和插件安装
软件下载链接：https://tbtools.cowtransfer.com/s/0a9cbf41b47b4a。下载安装好后，打开插件商店，分别安装Batch gPCR Primer Design和Primer Check两个插件。具体操作如下图所示
选中要安装的插件，点击install即可安装；如果安装成功，上面会显示安装的状态。安装成功的插件可以在TBtools下述的工具栏中找到
2.数据准备
两个fa文件，一个包含你的目的基因的mRNA序列的fasta文件，例如gene_mRNA.fa（用来设计引物）；
另一个是全基因组的mRNA序列文件（用来做引物特异性检测）,genome_mRNA.fa。
工作流程
很简单：设计引物→引物检测
设计qPCR引物
把上述的gene_mRNA.fa,按照下述步骤拖入软件中，可以按照自己需求调整输出的引物数量。例如我设置为2，则会输出2条引物。
几秒即可得到结果，结果如下：
检测引物特异性
按照下图所示，进入Primer Check功能，先对全基因组的mRNA的序列文件构建数据库（耗时稍长，但构建成功后，以后都能直接调用，无须再次构建）
构建成功后会有弹窗提示。然后将上一步得到的引物序列粘贴到旁边的工作栏中（格式：引物名+序列），设置输出文件，选中需要比对的数据库，运行程序
得到结果如下
根据结果预测的扩增结果，我们可以判断出哪些引物理论上的质量比较高。特别需要注意的是：对于像大豆这样的物种，由于是古四倍体，一个基因往往有多个拷贝，所以一定要选择只靶向目标基因的引物。记住：qPCR引物可以靶向同一个基因的多个转录本，但不能靶向到其它非目标的基因上。
结语
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