动植物鉴定的另一种方法：基于非聚合酶链式反应（PCR）的DNA方法进行现场物种鉴定以打击野生动物犯罪
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基于非聚合酶链式反应（PCR）的DNA方法进行现场物种鉴定以打击野生动物犯罪
Point-of-need species identification using non-PCR DNA-based approaches to combat wildlife crime
1、LAMP、RCA 和 RPA 提供快速、便携且更易于获取的物种鉴定方案；
2、检测设计虽复杂，但一旦建立，方法就可扩展且高效；
3、使用 CRISPR 和适配体结合的靶标检测技术显著提升了灵敏度；
4、侧向层析和微流体技术简化了样品制备和结果解析流程。
野生动物犯罪，即任何非法开发和交易野生动物的行为，它与毒品和武器走私一样，是一个利润丰厚的全球非法产业。它涵盖了野生动物及其制品的采集、运输、交易和最终使用。《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES，1973年）对其进行国际监管，目前野生动物犯罪主要通过形态学或DNA测序方法来检测。然而，业界对快速、便携且经济高效的筛查工具需求日益增长，以期突破耗时的工作流程和专业实验室设备的限制。现场检测，特别是在国际边境等野生动物犯罪高发地区，为快速发现非法活动提供了一个有前景的解决方案。环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等等温扩增方法，与传统的聚合酶链式反应（PCR）相比，因其对资源需求较低而受到青睐。这些方法可以与成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和适配体等靶标检测方法相结合，以提高检测灵敏度。将这些方法与侧向层析分析（LFA）和微流控芯片等技术相结合，能够简化样本制备和结果可视化过程。这些基因检测领域的创新技术已在疾病诊断和食品安全领域得到应用，可实现快速的现场检测。当应用于野生动物犯罪检测时，它们可以作为补充传统PCR和测序方法的工具。本综述探讨了基于非PCR的方法如何能够提供更快、更简便且更具成本效益的解决方案，以打击野生动物犯罪。
野生动物法医学在濒危物种犯罪的检测和起诉中至关重要，主要解决物种鉴定、样本与个体关联及确定物种地理来源这三个关键问题。以往物种鉴定多依赖形态学特征，但该方法主观性强、适用范围有限，基因方法因此得到更广泛应用。当下，科学界、执法机构和保护主义者越来越需要一种“样本进，结果出”的快速物种鉴定方法，这类方法需具备快速、便携、经济高效、易操作且保持高灵敏度和特异性的特点。等温扩增技术（如LAMP、RCA、RPA）与靶标检测方法（如CRISPR、适配体）能在低资源条件下实现高灵敏度和特异性检测。本综述旨在探究这些新兴基因方法的优势、局限性和实用性，为野生动物法医科学家提供更多的技术选择。
野生动物法医科学家在物种鉴定工作中面临诸多挑战。形态学分析虽然常用，可通过检查样本的外部身体部位和内部结构来鉴定物种，其存在主观性，且高度依赖专业知识，使得其现场应用受限。在处理深度加工物品时，其独特形态特征因加工过程消失，难以用形态学方法可靠鉴定；对于形态相似但基因不同的物种，形态学鉴定也难以准确区分，此时基于DNA的分子技术就显得尤为重要。
在野生动物犯罪物种鉴定技术的发展历程中，下一代测序（NGS）出现前，直接扩增长度多态性（DALP）等方法虽在食品认证和野生动物犯罪调查中有效，但其严重依赖DNA的数量和质量，存在重现性差且混合样本结果解读困难的问题；NGS的DNA宏条形码技术借助通用引物扩增标记物生成DNA“条形码”识别物种，可同时分析多个基因区域，灵敏度高且能确认结果，适合处理降解和低DNA含量样本，在分析包含多个分类群物种的样本时也特别有用；牛津纳米孔技术公司的纳米孔测序虽设备便携可现场使用，但错误率高，不过经技术改进后在野生动物犯罪物种鉴定中准确率超99%；基于PCR的物种鉴定方法成熟且通过便携式热循环仪和微流控设备提升了现场检测能力，而LAMP、RCA和RPA等新兴核酸扩增技术（NAATs），相比之下更快、更简单且成本效益更高，在高风险地区野生动物犯罪现场快速检测中更具优势。
核酸置换扩增技术（NAATs）包含等温扩增方法（如LAMP、RCA、RPA）和靶标检测方法（如CRISPR、适配体），为相关检测提供了有前景的解决方案。结合LFAs或微流控芯片，可简化检测流程，便于现场样品制备和扩增（表1、图 1）。
图 1. 展示了当前和替代的物种鉴定方法的流程总结，包括等温扩增（LAMP 、RCA 、和 RPA）、靶标检测（CRISPR或适配体）和结果可视化分析。（A） 等温扩增，然后直接进行检测，（B） 使用等温扩增方法进行预扩增，再利用 CRISPR 或适配体进行靶标检测或捕获，最后使用荧光检测、侧向层析分析（LFA）、微流控芯片检测等多种方法进行核酸可视化。
AMP是一种快速、灵敏、特异且稳健的方法，可用于病原体检测、食品认证及《濒危野生动植物种国际贸易公约》相关物种（如传统药物、鲨鱼、白犀牛、蛇等物种）鉴定。该方法由Notomi等人首次提出，LAMP反应涉及4种物种特异性引物（两种内引物FIP/BIP和两种外引物F3/B3）（图 2），借助有高链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下通过自动循环链置换扩增DNA，多种引物能在目标序列多个起始位点扩增，产生大小不同的茎环DNA结构混合物。因LAMP是等温的，用加热块等简单设备就能实现扩增。Nagamine等人引入的环引物（LF/LB）增加了扩增起始位点数量、提高了扩增效率，Sasaki等人在鉴定不同人参物种时证实，使用环引物可将阳性结果反应时间从70分钟大幅缩短至25分钟 。
图 2. LAMP扩增导致LAMP产物的机制，可以使用所需的可视化方法之一进行检测
LAMP阳性结果可通过浊度、比色法或荧光法可视化检测，为满足便携及不同通量需求，已开发出如 Genie （Optigene）等商业设备， LFA也常用于荧光 LAMP 的下游分析，以简化流程。LAMP 除快速简单外，还具高灵敏度，灵敏度因引物和检测设计而异，其高特异性源于引物数量多，在野生动物犯罪物种区分中LAMP 的高特异性尤为重要，特别是在区分亲缘关系很近的物种时，其中一种可能受保护，而另一种不受保护。LAMP 中引物增多也使得多重检测复杂、假阳性率上升，可通过多基因靶点、不同染料标记解决；或者，可使用微流控设备并行进行多个单重 LAMP 反应，消除引物竞争。
LAMP易出现非特异性扩增，且存在气溶胶污染问题，需优化检测参数、标准化流程来降低假阳性风险；在野生动物犯罪检测中，LAMP基于浊度、荧光或比色法等视觉指标结果仅作初步检测，需通过对产物测序（如利用纳米孔测序等快速便携式平台）来确认初步结果的有效性，以确定物种鉴定结果的准确性。初步检测与确认检测结合的 LAMP 方法还有助于检测在 LAMP 过程中可能共扩增的近缘分类群，例如，Imai 等人使用 LAMP 和纳米孔测序检测疟疾，发现一名个体同时感染了恶性疟原虫和间日疟原虫，而初步 LAMP 或巢式 PCR 未能检测到这一结果。
RCA是基于细菌和病毒滚环复制过程的等温扩增方法，可独立检测核酸或作为预扩增步骤与其他DNA 捕获方法联用使用。它使用单链环状模板、聚合酶和引物来扩增DNA，反应在37°C恒温下进行，所需试剂和设备少，这使得它成为在资源匮乏或现场条件下进行物种鉴定的有吸引力的选择。RCA产物可视化方法多样，包括比色法和荧光法，可结合微流控芯片或侧向层析分析进一步优化，这些检测方法多样，需根据具体应用需求（如灵敏度、设备可用性和现场使用考虑因素）选择合适方法。
RCA凭借易用性、低资源需求和高效扩增等优势，在疾病诊断、食品安全和环境监测等领域取得显著进展并不断创新，从单目标检测发展到多重检测系统。然而，其在识别《濒危野生动植物种国际贸易公约》所列物种方面应用受限，因需环化模板，在多重检测方面存在挑战，另外处理非天然环状模板时需增加连接步骤，如使用锁式探针，这增加了时间、试剂消耗和方法复杂性，降低了在快速现场应用中的实用性 。
RPA是一种等温扩增方法，因操作简便、反应快速、对资源要求低[CM1] 等优势，在细菌、真菌、寄生虫检测、临床样本分析及食品认证等领域广泛应用。其扩增反应在37 - 40°C进行，包括重组酶、单链结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶，通过一系列反应产生双链DNA产物。RPA适合现场即时检测，扩增速度快、操作简单、对常见抑制剂有耐受性，与环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）等方法相比，能更快出结果，检测设计更简单，多重检测更易实现（表1），且试剂冻干形式提升了现场检测中的实用性。多项研究证明RPA在物种鉴定方面有效（表2），如Kissenkötter等人开发的方法能在移动手提箱式实验室中11分钟实现肉类掺假检测，Zhao等人将RPA与CRISPR - Cas12a技术结合，可在30分钟内检测出低至10 fg的猪肉DNA 。
尽管RPA具有多种优势，但在检测CITES物种时其实用性存在显著的局限。其一，缺乏专门的RPA引物设计软件，研究人员需依赖未经优化的PCR引物设计工具，导致引物选择与反应优化复杂，常需反复尝试；其二，RPA引物较长，在处理野生动物案件中常见的降解样本时，会降低检测灵敏度；其三，RPA商业试剂盒供应有限，主要依赖TwistDx单一供应商，市场竞争不足致使试剂成本高昂。这些局限性使得RPA在现场即时检测（含野生动物犯罪检测）的广泛应用形成重大阻碍，尽管未来发展或可提升其实用性，但目前仍面临严峻挑战。
表 2.使用与野生动物犯罪应用相关的非基于 PCR 方法的研究汇总
CRISPR核心组件包括向导RNA、Cas效应蛋白和信号转导器。Cas12和Cas13常用于核酸检测，利用反式切割活性，结合荧光团-淬灭剂报告分子实现高灵敏、快速且特异性检测，是现场物种鉴定的理想选择。在检测方面，CRISPR-Cas系统可直接检测目标序列，对高浓度靶标有足够灵敏度，对低丰度靶标常结合等温扩增方法（如LAMP和RPA）提升灵敏度。基于CRISPR检测的可视化方法，包括荧光法、比色法、侧向层析分析法和微流控装置法。在物种鉴定应用上，CRISPR技术已用于肉类样本中猪肉、鸡肉和鸭肉的识别（灵敏度低至1pg/µL），也可结合微流控装置区分三种密切相关的曼陀罗种子（检测限为每微升一个拷贝）；特异性高灵敏度酶促报告解锁技术（SHERLOCK）能区分三种常被误认的鱼类物种（濒危的三角洲胡瓜鱼、受威胁的长鳍胡瓜鱼和非本地的池沼公鱼），有较高的物种特异性，改进后使用环境DNA水样实现了仅三个拷贝的灵敏度；DNA核酸内切酶靶向CRISPR转录报告技术（DETECTR）可从河水样本环境DNA中识别鱼类物种，实现阿托摩尔级灵敏度，2.5小时内完成检测，这些技术为生物多样性监测提供了高效替代方案。CRISPR - Cas系统的高度可定制性为开发满足特定需求的方法提供了灵活策略。在野生动物犯罪应用中，预扩增技术可提高对低含量DNA的检测灵敏度。尽管将CRISPR整合到工作流程会增加复杂性、成本、时间和设备需求，但在对精度要求高的野生动物犯罪调查中，提高的灵敏度和特异性可能足以弥补这些不足。
适配体是 1990 年首次提出的小型合成单链 DNA 或 RNA 配体，能通过氢键、静电相互作用或范德华力等高度特异性结合金属离子、氨基酸、有机分子、蛋白质、细胞等多种靶标，常作为天然抗体替代品 。适配体的筛选通过一种称为SELEX（指数富集的配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）的过程实现，伴随用于预测适配体结构的计算机软件的发展，其开发时间从数月大幅缩短至数小时。在应用层面，适配体凭借高特异性、室温稳定性和低成本等优势，广泛用于疾病诊断的病原体检测、食品安全检测及药物递送等领域。常与 PCR、LAMP、RCA 等预扩增方法联用提升灵敏度。此外，适配体作为目标捕获工具无需 DNA 提取，突破了传统扩增技术的流程瓶颈，简化检测流程、减少设备依赖。尽管其检测设计较复杂，曾限制应用，但在现场即时检测领域潜力巨大，尤其在野外快速识别濒危或受保护物种方面优势显著。
5、基于 DNA 的野生动物物种鉴定方法面临的常见挑战
野生动物案件中样本常存在DNA含量低、易降解且含抑制剂的问题，样本处理和储存条件更会加剧这些状况，需复杂实验室规程才能提取足够DNA用于可靠检测。尽管LAMP、RCA和RPA等扩增方法对设备要求低，但与缓慢昂贵的DNA提取方法结合，在现场检测中它们难以发挥作用。微流控设备为此提供有效解决方案，它能实现样本提取到结果输出的全流程自动化快速操作。其简化提取流程，且不影响检测的灵敏度、特异性和准确性，使在现场对具有挑战性的样本进行快速高效的物种鉴定成为可能，推动现场检测的可行性与可扩展性发展。
使用基于DNA技术的野生动物案件在结果解读上存在共同挑战，即缺乏濒危物种的高质量参考数据，而基因鉴定依赖与参考序列比对，参考序列的质量和全面性影响鉴定准确性。一个优质参考数据库需包含待鉴定物种序列及足够遗传数据以解释个体差异等。例如，使用细胞色素B（CytB）序列鉴定时，不同类群物种与原物种相似度不同，鸟类、爬行动物和鱼类变异性高，主要是其在数据库中代表性不如哺乳动物和两栖动物。最大的公共数据库EMBL - Bank和GenBank虽积累了大量DNA序列，但存在质量控制不佳问题。内部整理的参考数据库质量和可靠性方面更具优势，然而构建和维护濒危物种数据库资源消耗大，单个组织难以实现。这表明通过全球合作以创建集中、全面且可靠的数据库很有必要，以确保濒危物种在相关应用中得到充分的代表性和可访问性。
野生动物犯罪案件中物种鉴定需科学可靠以经得起法庭检验，这要求清晰的文件记录、监管链及可靠且可重复的方法。由于其为新兴领域，不同司法管辖区实验室间检测和分析方法标准化面临挑战，因资金缺乏，仅不到44%野生动物法医实验室遵循质量保证标准。为此，法医科学组织科学领域委员会（OSAC）等多个工作组和委员会成立，已发布传统方法的标准指南，还需纳入新一代测序（NGS）和非 PCR 方法等新技术；野生动物法医科学协会在推动能力验证计划以助实验室达ANAB的标准认可方面有关键作用，不过目前计划仅限于少数哺乳动物物种，扩大范围并制定质量标准，有助于野生动物法医学物种鉴定建立更高的一致性和可信度。
本综述介绍了等温扩增（如LAMP、RCA、RPA）结合CRISPR、适配体等目标检测方法，相较于传统PCR方法，具备快速、易操作、成本效益高、灵敏度高和特异性准确等优势，结合侧向层析分析或微流控设备可简化样本制备，与纳米孔测序联用能确认鉴定结果，有助于加快野生动物犯罪起诉，保护濒危物种。这些方法是对PCR和下一代测序的补充，可减少对实验室的依赖，加快了对野生动物非法交易的应对速度，同时资源可重新分配用于环境DNA监测。新技术如人工智能可优化样本制备和结果报告流程，根据样本类型选择合适方法，创建资源集中型数据库，从而跟踪新兴趋势，如非法交易模式的变化。AI 还可用于整合各种证据类型，增强鉴定效力，提高数据可比性。网络非法交易兴起，即利用在线平台进行犯罪活动，往往能够逃避监管。区块链技术为应对网络非法交易提供了一个有前景的解决方案。其通过二维码或射频识别（RFID）技术，可为合法的野生动物产品创建区块链记录，为合法产品创建不可篡改记录来检测非法交易。本综述倡导使用替代检测方法改进野生动物犯罪中的物种鉴定，利用传统遗传标记提供可靠结果，整合简化样本制备技术实现快速检测，结合先进技术增强检测有效性，利用创新技术提升数据分析、监测和产品认证，提高准确性、可扩展性和效率。这些集成工具将有助于支持全球保护珍稀濒危物种免受过度开发和灭绝的倡议。总之，这些进展为应对打击野生动物犯罪过程中不断升级的复杂挑战，提供了更高效、更灵活且更具适应性的解决方案。
文献链接：https://www.fsigenetics.com/article/S1872-4973(25)00058-4/fulltext
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