摘要
2021年12月，中科院长春光机所李备研究员团队联合牛津大学黄巍教授，在期刊《Applied and Environmental Microbiology》上发表文章“Isolating and culturing of single microbial cells by laser ejection sorting technology”。
该工作使用长光辰英（HOOKE Instruments Ltd.）的单细胞分选仪（PRECI SCS）, 基于激光诱导向前转移技术（Laser induced forward transfer, LIFT）,实现对微生物单细胞的精准分离，同时在传统LIFT基础上，通过增加保护层设计三层结构弹射芯片，隔绝弹射过程中热对细胞的损伤，进而实现微生物单细胞层面的分离与培养，更好的满足不同单细胞分选的研究。
研究背景
单细胞分离和培养在研究微生物的生理、基因表达和功能中起着重要作用，目前常用的单细胞分离方法有显微操作(Micromanipulation)、激光显微切割(Laser Capture Microdissection, LCM)、流式细胞分选(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)、磁力分选(Magnet-Activated Cell Sorting, MACS)、光镊分选(Optical Trapping)、激光诱导向前转移(Laser induced forward transfer, LIFT), 相比于其他分选技术，LIFT技术的优势在于分选过程可视化，分选精准(对500nm微生物进行分选)，可以不依赖于荧光标记，适用于固体、液体等不同样本，但LIFT过程中的热、力等因素对细胞的活性的影响需要避免。
图文导读
1. 激光诱导向前转移装置以三层结构芯片设计
图一、激光诱导向前转移装置、三层结构芯片设计示意图
图一a中下半部分为显微成像模块，上半部分为LIFT弹射模块，样本附着在芯片上(Chip)倒装于载物台上，在显微成像模块观察微生物样本时，接收装置(Receiver)在成像光路外，当确定待分选目标后，控制接收装置移动至目标细胞下，触发弹射分选将目标细胞弹射至接收装置中。
图一b三层结构芯片中，第一层：铝膜，用于吸收脉冲激光转化成热量，热变形后产生弹射力；第二层：固体培养基（主要成分Agar），作为中间保护层，隔绝热量对细胞的损伤，如图二所示，在激光脉冲作用下，第一层铝膜温度迅速提高，而第二层10ns后温度开始提升、第三层30ns后温度开始提升，弹射过程发生在第一层温度达到最高的时刻（10ns左右），在温度没有作用到细胞时，就已完成弹射分选；第三层：液体培养基，为细菌提供营养物质。
图二、三层结构LIFT芯片温度仿真
2. 微生物单细胞的弹射与接收
图三、微生物单细胞的弹射与接收
图三所示为微生物单细胞弹射与接收示意，以图a-d为例，a为弹射之前芯片上酵母菌图片，b为弹射后酵母菌单细胞被弹射，c为弹射前接收装置图片，d为弹射后接收装置接收到弹射的酵母菌。通过优化弹射参数，可实现微生物单细胞的精准弹射与接收，如图m-p所示，经过5次单细胞弹射后，接收到的5个细菌的分布与弹射之前分布一致。
3. 微生物单细胞弹射与培养
图四a为三层结构芯片，b为装有液体培养基的PCR管盖，c为弹射接收实物图，d将接收到的单细胞通过移液枪转移到培养管中进行培养12h，e培养得到的菌液测量OD600，f,g分别为JM109、Yeast两种微生物的OD600图，其中实验组（粉红色），相比于空白对照（灰色）明显浑浊度高，相比于挑一个菌落培养（橘黄色）值偏低，由于实验组是单个微生物单细胞进行培养，相比于单个菌落培养，OD600值偏低。
图四、液体培养基接收与培养
为更好地量化单细胞微生物培养接收，通过装有固体培养基的平皿进行接收与培养，将三种典型微生物Yeast、E.coli、LGG分别弹射于接收平皿的9个预设位置，培养结果如图五所示。
图五、三种微生物固体培养基接收与培养
4. 荧光标记微生物单细胞弹射与培养
将带有荧光标记基因的JM109与土壤微生物样本混合，通过荧光信号可以精准区分目标微生物与土壤微生物以及杂质(图六a)，将其弹射到固体培养基中进行培养(图六b)。
图六、荧光标记微生物单细胞的弹射与接收
结论
该研究通过三层结构LIFT芯片设计，隔绝了激光弹射过程中热量对微生物单细胞的损伤，实现了单细胞层面微生物的分离与培养，并将荧光标记微生物从复杂土壤样本中分离并进行培养，扩展了激光诱导向前转移弹射分选的应用范围，为更多单细胞分离培养研究提供有力工具。
参考文献
Peng Liang, Bo Liu, Yun Wang, Kunxiang Liu, Yinping Zhao, Wei E. Huang and Bei Li, "Isolating and culturing of single microbial cells by laser ejection sorting technology". Appl Environ Microbiol. 2021 Nov 24: AEM0116521.
doi: 10.1128/AEM.01165-21. Epub ahead of print. PMID: 34818099.
链接网址
https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.01165-21?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
PRECI SCS单细胞分选仪具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，能够在非标记状态下进行分离。适用范围广，对于亚微米级的单个微生物细胞也可分离。可与形态、荧光、拉曼光谱等多种细胞识别技术结合，应对不同应用场景。全自动操作，具有单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等功能。为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。
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