在 Western Blot（WB）检测多次跨膜蛋白时，制样避免高温煮样（如 95℃加热）的核心原因是：膜蛋白具有疏水性，高温加热后易发生聚集并形成二聚体或多聚体，甚至形成沉淀滞留在胶孔中，不能被抗体很好地识别，或导致识别后条带位置不在预期大小位置。
在一篇发表于《PLOS ONE》的Transmembrane protein western blotting: Impact of sample preparation on detection of SLC11A2 (DMT1) and SLC40A1 (ferroportin)文章中，作者聚焦于跨膜蛋白在WB检测中样品制备的关键影响因素，以铁代谢核心跨膜转运蛋白SLC40A1、SLC11A2为主要研究对象，结合单跨膜蛋白TfR1、胞质铁储存蛋白Ferritin H展开实验，证实高温煮样是跨膜蛋白 WB检测失败的核心原因。（详见原文）
图 1 转染 Fpn1 的细胞样品加热 / 未加热处理后SLC40A1的 WB 对比。A）取 pCMV/pCMV-Fpn1 转染的 HEK293 细胞 RIPA 裂解液 25μg，与 2×SDS-PAGE 上样缓冲液混合后 95℃加热 5min 做 WB，箭头示滞留于分离胶顶部的 Fpn1 蛋白（B、C 同）。B）提取上述转染细胞的 RIPA 裂解液、RIPA + 冰浴超声裂解液、跨膜蛋白提取试剂裂解液，各取 15μg 制样后分 95℃加热 5min 和室温未加热组做 Fpn1 WB，三角箭头示转染的 Fpn1 条带。C）取上述转染细胞的 RIPA 裂解液，分别与含 5%β- 巯基乙醇、4M 尿素、5%β- 巯基乙醇 + 4M 尿素的 2×上样缓冲液混合，分加热 / 未加热组做WB，左侧标注蛋白分子量标准位。
图1结果表明转染 Fpn1的HEK293细胞样品经95℃加热5min后，Fpn1蛋白会滞留于分离胶顶部无法正常迁移；而未高温处理可检测到清晰的 Fpn1 特异性条带。更换 RIPA + 超声、跨膜蛋白专用提取试剂等裂解方式，或使用含尿素/不同β-巯基乙醇的上样缓冲液，均无法改善高温导致的 Fpn1 迁移异常，仅不使用高温处理是实现Fpn1有效检测的关键条件。
图 2 铁处理的 Caco-2 细胞在加热 / 未加热条件下Ferritin H与 TfR1 的 WB 对比。Caco-2 细胞经 50μM 血红素、250/500μM FAC、25μM DFO 处理 24h 或不处理，取 25μg 其全细胞裂解液，同时取 10μg pCMV/pCMVFpn1 转染的 HEK293 细胞裂解液，分 95℃加热 5min 和室温未加热两组，依次用抗 Fpn1、DMT1、Ferritin H、TfR1 及 GAPDH 抗体做连续 WB 检测。A)图旁附 HEK293 细胞 Fpn1 WB 放大结果，箭头示滞留于分离胶顶的转染型 Fpn1；D)中星号为仅未加热样品中出现的 TfR1 二聚体。
图2铁相关试剂处理的 Caco-2细胞及Fpn1转染的HEK293细胞样品，经加热/未加热后进行WB检测。结果表明Fpn1在未加热样品中条带更清晰，转染的Fpn1加热后滞留分离胶顶（多次跨膜）；DMT1仅在未加热样品中可检测到（多次跨膜）；Ferritin H则仅加热后能被有效检测（胞质）；TfR1在未加热样品中条带信号更强，且能检测到仅存于未加热组的二聚体（单次跨膜）。
我们以SLC40A1为例，打开https://www.uniprot.org/官网，在搜索栏中输入SLC40A1，选择Human后网页会进行跳转。我们点击Subcellular Location选项后，能看到右边蛋白在细胞中的定位，并且下面的DESCRIPTION处能够看到其螺线结构，胞质和胞外对应的氨基酸序列。那根据这个我们就可以确定制样的方式啦。
