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结构照明显微镜(SIM)从当前的超分辨率(SR)光学纳米显微镜方法中脱颖而出，因为它具有快速多色采集、高效的光子预算以及与一般荧光标记方案的兼容性。目前，大多数SIM算法都遵循流行的线性Wiener反卷积框架，该框架涉及到照明模式的精确确定和傅里叶域反卷积。重建高质量的SR图像通常需要对实际点扩散函数(PSF)进行专门校准。然而，这三个过程中的小参数误差已被证明会导致大量伪影。如果样本过于稀疏或具有明显的周期性结构，现有方法往往无法确定准确的模式参数。更关键的是，实际成像参数包括照明模式和首选PSF通常在视场(FOV)上是不均匀的。然而，Wiener-SIM假设这些参数在视场中是常数，这通常会导致不合理的重组频谱和Wiener反卷积产生的严重伪影。
2024年，复旦大学Li、Wen等人提出了一种直接重构SIM算法(direct-SIM)，该算法首先进行空域重构，然后进行频域频谱优化。在没有任何照明模式的先验知识和绕过伪影敏感的维纳反卷积的情况下，即使对于视场中具有大模式方差的原始图像，也可以通过direct-SIM法重建无常见伪影的SR图像。Direct-SIM可以应用于以前困难的场景，如非常稀疏的样本、周期性样本，小视场成像和缝合大视场成像。该工作在期刊PhotonicX上以“Spectrum-optimized direct image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy”为题发表。
光学切片(OS)SIM通过对原始数据的差异取均方根(RMS)来实现增强的OS能力。基于均方根的方法基本上都只有正负一阶谐波对结果有贡献。受此启发，direct-SIM提出了一种改进的RMS形式的空间域重构模型，其中所有谐波分量都对SR图像有贡献。如图1所示，第一项是+1阶和-1阶谐波的卷积结果，包含了提高空间分辨率的高频信息。第二项为0阶谐波的自卷积项，表示低分辨率信息。Direct-SIM的流程包括四个步骤：预处理（去除背景荧光，通过RL反卷积增强等效调制深度），等效调制深度分别为0.312、0.378、0.495（未经预处理）和0.572、0.699、0.772（预处理），通过RMS- SR模型在空间域直接重建初始图像；通过非线性频谱优化提高图像对比度；通过RL反卷积重建最终SR图像。
图1 Direct-SIM超分辨机理及流程图。
图2作为概念验证，描述了direct-SIM的超分辨能力。采用自制的激光干涉SIM对直径为100 nm的荧光珠(F8803, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)进行成像，采集的数据分别通过HiFi-SIM和direct-SIM进行重构。在宽场图像中，许多致密的小珠难以区分，呈现为簇状斑点（图2a）。正如预期的那样，通过direct-SIM获得的SR图像与HiFi-SIM获得的图像非常相似，其中聚集的珠子被分解为可区分的单个珠子（图2a-c）。通过direct-SIM，单个微珠的平均轮廓的半最大值全宽度(FWHM)为109.1±5.2 nm，对应于宽场成像的2.2倍分辨率增强（图2d）。通过SQUIRREL分析插件对direct-SIM的图像质量进行评估，显示分辨率缩放的Pearson系数(RSP)优于0.93（图2e），从而在高置信度下验证了direct-SIM的超分辨能力。该分支可以结合空间域和频域的特征，并给出最终输出，即图2中单独的条纹图像。
图2 Direct-SIM超分辨能力的定量验证
作为一种典型的生物样本，固定COS-7细胞中的微管被作为比较目标如图3所示，采集的数据分别用HiFi-SIM和direct-SIM进行重构。Direct-SIM具有与HiFi-SIM相当的高质量重建。图3b、c的放大图像和截面图显示，微管紧密排列，间距小于光学衍射极限可以使用direct-SIM一致地分辨。将direct-SIM图像与HiFi-SIM图像叠加，进一步证实了directSIM与基于wiener的SIM重建技术的一致性（图3d）。direct-SIM和HiFi-SIM结果的差异主要出现在背景散焦较强的区域，如图3e所示。这些差异是由于高背景导致相应区域的调制深度较低（图3f）。尽管不涉及估计照明模式，调制深度本质上决定了SR图像质量。SQUIRREL误差图再次验证了重建误差主要集中在背景高度散焦的区域（图3g），由于direct-SIM的良好OS能力，这些信号通常会从SR图像中去除（图3a，e）。为了提高强背景区域的SR图像质量，可通过适当减少经验系数的取值来单独重建该区域。总的来说，这些结果表明，该方法在可接受的质量样品中有效地解决了精细细节。
图3 Direct-SIM提高COS-7细胞微管成像分辨率
为了验证direct-SIM抑制传统SIM中容易出现的伪影的能力，在自制装置上对COS-7细胞中的微管进行成像，并分别使用fairSIM、HiFi-SIM、SP-SIM和direct-SIM重建SR图像（图4）。显然，fairSIM重建的SR图像包含严重的副瓣伪像和蜂窝伪像（图4a，e）。使用HiFi-SIM，图4a中的大部分伪影被有效消除（图4b）。虽然SP-SIM不需要事先了解照明模式，但其重建的频谱在低频区域表现出明显的非线性增长(图4c)，使得SR图像不仅包含高背景信号，而且与fairSIM和HiFi-SIM的视觉可见度也大不相同（图4c，e）。更棘手的是，SP-SIM的SR图像中的一些结构特征变得明显不连续，因为只有高阶分量对重建结果有贡献。相比之下，directSIM通过预处理和频谱优化，克服了空域重建模型中低频区域相对幅值远高于高频区域的难题。
图4 Direct-SIM抑制COS-7细胞微管典型SIM伪影
Direct-SIM提供了可与最先进的Wiener-SIM算法相媲美的空间分辨率，而无需事先了解照明模式。在许多难以从原始数据中准确估计照明模式参数的成像场景、采集数据具有非均匀模式参数以及一些具有高背景的样本中，direct-SIM优于包括HiFi-SIM在内的高级基准算法。一方面，受益于避免了麻烦的参数估计；在样本过于稀疏或具有明显周期性、成像视场很小等难以确定精确照明模式的情况下，direct-SIM保证了SR-SIM的可靠应用。另一方面，绕过了传统Wiener-SIM结构中对伪像敏感的滤波反卷积过程，从而鲁棒地抑制了频繁出现的副瓣伪像和周期性蜂窝伪像。更重要的是，由于direct-SIM具有非均匀模式参数的重构机制，可以对包含多组不同模式的原始数据实现高质量的重构。
原文链接：
https://doi.org/10.1186/s43074-023-00092-6
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