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共聚焦荧光显微镜因其能够去除图像焦平面以外区域的模糊而成为生命科学研究人员常用的工具。针对这一原理，已经发展出多种类型的共聚焦显微镜，每种类型都有其各自的优点与局限性。本文将介绍以下几种共聚焦显微镜：光栅共聚焦显微镜、经典共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、共振扫描CLSM，以及转盘共聚焦显微镜。文章将依次阐述每种显微镜的工作原理、最适用的应用场景、技术上的局限性以及各类技术的最新发展。对于那些可以使用多种共聚焦显微镜（例如通过本地共享平台）的研究人员来说，本文将有助于选择最适合特定成像应用的共聚焦技术。而对于计划购置仪器的研究人员而言，本文也将为其选择最符合研究需求的技术提供有价值的参考。
Figure 1.Comparison of 3D imaging techniques.
Figure2.Performance of the grid confocal microscope.
Figure 3.Schematic diagram of the CLSM.
Figure 4.Basic CLSM light path.
Figure 5.Demonstration of the flexibility of the CLSM for scanning different sizes of the FOV with optimal resolution.
Figure 6.Basic SDCM light path.
Figure 7.Live-cell SDCM time series images.
Figure 8.FOV comparison for an SDCM and a CLSM.
结论
总而言之，在选择三维共聚焦显微镜平台时，有许多可供考虑的选项。最基础的形式是光栅共聚焦，它可以添加到一个宽场显微镜上，并利用现有的光源和相机。光栅共聚焦价格低廉，但其速度慢、灵敏度低、分辨率不高，且易受噪声和图像伪影影响。
转盘共聚焦显微镜（SDCM）则专为高速成像而设计，非常适合对1–2种荧光探针进行的薄至中等厚度样本的三维活细胞成像。与CLSM相比，它的结构更为简单，因此维修和维护成本也更低。对于高速应用来说，它的视场（FOV）有限，x、y、z方向的分辨率较低，最适用于高倍率的浸没式物镜。近年来在高功率激光器、相机技术以及多功能旋转盘设计方面的进展，有望使SDCM拓展到更广泛的应用领域。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）依然是最为多功能的系统，配备多种激光、多种探测器、可变针孔大小，并且可以通过控制激光扫描精度来调整像素大小。它可以针对高倍或低倍成像需求进行优化，适用于大小样本（即大小视场）的成像。其在x、y、z三个维度上都具有较高的分辨率，多色成像也已成为常规操作。CLSM的主要缺点是成像速度较慢。新一代CLSM结合了传统扫描与高速共振扫描镜，成功弥补了这一不足，同时保留了CLSM的全部优势，并具备高速成像能力。
参考文献：1、Jonkman J, Brown C M. Any way you slice it—a comparison of confocal microscopy techniques[J]. Journal of biomolecular techniques: JBT, 2015, 26(2): 54.
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