CETSA-PEA黑科技｜联合实现高灵敏高通量超多重药靶互作研究- 大数跨境

伯豪生物

2021-12-06

「药靶互作」背景

药物靶点指药物发生有效作用的生物分子，通常包括受体、酶、离子通道、转运体和基因等。科学家们一直期望药物仅作用于疾病治疗相关的靶点，而不与药物设计之外的靶点产生作用（即脱靶效应）。脱靶效应（off-target effects）又称为药物副作用（Adverse Drug Reaction, ARDs)。虽然有时候药物的脱靶效应也可能使某些患者获益从而产生新的适应证。比如，辉瑞大名鼎鼎的“伟哥”就是因为发现受试者在服用原本用于治疗心绞痛的西地那非时出现阴茎勃起这一副作用，但这仅是意外「惊喜」。然而，在大多数情况下，未知脱靶效应通常是设计者不期望且对患者有害的，其可能阻碍或停滞候选化合物的研发进程。如果是在已被批准之后发现，甚至可以导致已上市的药物撤市。比如，2019年9月，《Science Translational Medicine》上发表的一篇论文显示，目前至少有10种处于临床阶段的抗癌药并未靶向预期靶标，面临极高的失败风险。

近年来，抗肿瘤领域创新疗法发展日新月异，如CART细胞治疗、小分子干扰RNA（siRNA）、CRISPR/ Cas9基因治疗以及近期大火的PROTACs蛋白降解疗法给人们带来很高期望。然而，即便是这些最前沿的技术，也未能摆脱脱靶效应的困扰。因为这些技术的靶标多为肿瘤相关抗原/基因，后者并非肿瘤细胞所特有，在正常组织中也有不同程度的表达。因此，对肿瘤相关靶抗原亲和力强和杀伤力强的治疗方法在清除肿瘤细胞的同时，也会攻击正常组织，造成组织器官损伤。

脱靶效应（off-target effects）示意图

为了在研发进程中尽早发现这些潜在风险，药物研发公司多利用体外药理学分析在体外检测药物对纯化的标靶蛋白的结合亲和力，研究小分子药物与药物靶标的相互作用，从而来发现脱靶作用。然而，体外筛选并不能真实模拟人体内复杂的环境，有些通过体外筛选的药物在人体试验时会表现出较强的脱靶效应，甚至可能与设计的靶点毫无相互作用。因为，绝大多数药物的靶点是在细胞内，而不同化合物进入细胞的能力又受到胞膜渗透性、膜运输蛋白等多种因素的影响。所以检测药物在细胞内对靶标蛋白的相互作用及脱靶效应具有更高的新药研发指导意义。

CETSA-PEA技术特点

瑞典Pelago Bioscience公司依据蛋白和药物结合时热稳定性有所提高的特征，开发了一种称为细胞热漂移分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）的实验方法，可直接在细胞或组织内检测药物和靶标蛋白的结合亲和力。具体而言，该方法通过将目标细胞和药物在不同温度下共培育一定时间后裂解，与药物结合的蛋白会因为热稳定性提高而更不容易发生变性而沉淀，随后通过离心把沉淀的未结合蛋白去除，最后通过蛋白免疫印迹法（Western Blot）或其他蛋白检测技术检测上清液内的蛋白即可获知与该药物结合的蛋白谱，从而研究其药靶相互作用及相应脱靶蛋白。

CETSA-PEA原理图

然而CETSA结合WB或质谱等传统蛋白检测方法仍然具有一些局限性，比如蛋白质印迹法在通量和多重性方面受到限制。虽然，一些商品化的均相免疫检测技术能够对大量化合物的药靶互作进行高通量筛选，但仅限于单一有限标记的蛋白。质谱方法虽然可以检测更多蛋白，但质谱检测的灵敏度偏低，会遗漏某些低丰度蛋白或者特定感兴趣的蛋白靶标。并且，目前这些方法都需要较多的起始样本量，无法对一些样本量非常有限的样本（例如，临床样本、原代细胞等）中的特定目标蛋白进行高灵敏度、高通量和多重分析，从而无法获得更全更高分辨率的药靶互作蛋白谱。

CETSA-PEA流程图

基于邻近延伸分析技术 (Proximity Extension Assay, PEA) 的Olink蛋白检测技术允许对超微量样本（1微升的细胞裂解液，甚至单细胞）中近3000多种蛋白质进行平行定量，且具有极高的灵敏度和特异性。因此，PEA技术具有极大技术优势可与CETSA技术结合，实现药物-靶点相互作用的高灵敏度、高通量和超多重检测分析。

激酶抑制剂案例

近期，来自瑞典乌普萨拉大学的研究人员将Olink PEA技术与CETSA技术相结合，初步验证了CETSA-PEA技术在药靶互作高通量检测中的应用价值。相关结果发表在《Anal. Chem》杂志。在该研究中，研究人员通过CETSA-PEA技术研究了三种ATP竞争性激酶抑制剂与67种相关靶点蛋白在人类癌细胞中的结合情况。并证明由CETSA-PEA检测出的药靶互作结果与由CETSA-MS方法具有良好的一致性。且与相应样品的CETSA-MS分析结果相比，CETSA-PEA 方法学结果显示在对靶标蛋白BRAF、CDK2、CDK4、MAPK8、PTK2B 和 TNKS 的数据分析中对热变性动态变化具有更高的灵敏度。

CESTA-PEA 和 CESTA-MS结果对比

通过CETSA-PEA方法检测三种激酶抑制剂（达沙替尼、吉非替尼和星形孢菌素）在K-562癌细胞中的靶标蛋白结合情况，从下图中可以看到，窄谱激酶抑制剂（Narrow-Spectrum Kinase Inhibitor）吉非替尼对非靶向蛋白CDKN1A和BIRC5也发生了显着的热漂移，很可能是一种未发现的脱靶作用。

CETSA-PEA方法检测三种激酶抑制剂药靶互作结果

写在最后

此研究作为初步方法学验证，证明了新药研发人员可以基于CETSA-PEA技术，实现在更小的样本量中，更高质量地检测更多的药靶互作和脱靶效应。我们也期待技术的进步可以推动加速更多具有良好疗效的创新药的研发进展，以满足各个疾病领域患者的临床需求。

参考文献：

Al-Amin, Rasel A., et al. Sensitive Measurement of Drug-Target Engagement by a Cellular Thermal Shift Assay with Multiplex Proximity Extension Readout. Analytical Chemistry (2021).

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