高效液相色谱法方法验证中耐用性验证方法和可接受标准探讨

《中国药典》2020年版四部指导原则9101对分析方法验证的指标进行了规定，验证指标共分为8个，分别为专属性、准确度、精密度、检测限、定量限、线性、范围和耐用性，同时对8个验证指标分别进行了说明。对于前7个验证指标，指导原则9101均给出了验证方法和可接受标准，但对于耐用性项目，仅给出需要验证的典型变动因素，对验证方法和可接受标准则只以一句话“经试验，测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求，以确保方法的可靠性”来概括，这样就导致行业内进行高效液相色谱法新方法开发时，耐用性项目的验证方法五花八门，可接受标准的制定也是各有不同。

首先来了解一下耐用性，耐用性是分析方法验证中重要的指标，系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。耐用性中典型的变动因素有被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等，而液相色谱法中典型的变动因素有流动相的组成和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。

《中国药典》2020年版四部通则0512高效液相色谱法中对色谱参数允许调整的范围作出了相应规定：流动相比例在最小比例相对值的70%~130%和绝对值±2%之间取较大者；流动相pH为±0.2；柱温为在等度洗脱±10℃，在梯度洗脱±5℃；流速为±50%；流动相磷酸盐浓度±10%。需要特别注意的是，通则0512明确规定检测波长不允许改变。

根据高效液相色谱法耐用性验证采用的验证方法和可接受标准的不同，选择比较有代表性的六家企业的方法和数据进行分析比较，以总结出一个适用性广的验证方法和可接受标准，用于后续高效液相色谱法耐用性项目的验证。企业名称缩写分别为HR、CRO、FD、HZ、KL和AY。

总结六家企业进行含量测定和有关物质方法的研究时，耐用性项目的验证方法和可接受标准见表1和表2。

表1  含量测定耐用性验证方法和可接受标准

表2  有关物质测定耐用性验证方法和可接受标准

就验证方法来看，六家企业在含量测定和有关物质测定的验证内容是相同的，基本是按照《中国药典》2020年版四部指导原则9101中规定的液相色谱法典型变动因素（流动相的组成和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等）来制定的。

在指导原则9101中规定的液相色谱法5个典型变动因素（流动相比例、流动相pH、色谱柱、柱温和流速）变动强度的选择上，六家企业存在一定的差异。表3为六家企业在含量测定耐用性验证中5个变动因素强度统计，表4为六家企业在有关物质测定耐用性验证中5个变动因素强度统计。

表3  含量测定耐用性验证方法

表4  有关物质测定耐用性验证方法

 表3、表4数据结合通则0512中的规定可以发现：

（1）在流动相比例上，并不是变动强度越大越好，当变动强度超出±2%时，基本可以判断超出了通则0512规定的范围，故选择±2%进行验证，在变动强度上足够，在法规符合性上为最佳。

（2）根据通则0512中两种洗脱方式下柱温的最大允许变动范围，选择等度洗脱的最大允许变动范围±5℃进行验证，能兼容所有液相方法，6家企业中有5家是如此选择的。

（3）鉴于大多数液相色谱方法的流速在0.5ml/min~1.5ml/min之间，选择流速±0.2ml/min进行验证是合适的。

（4）流动相的pH按照通则0512进行验证即可。色谱柱按照指导原则9101液相色谱法中典型的变动因素字面描述：不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱进行验证即可。

综上可以总结出耐用性验证方法最佳选择，变动因素和相应的变动范围见表5。该结果与AY的验证方法基本一致。

表5  耐用性各变动因素的最佳变动范围选择

再来说说耐用性验证的可接受标准，可接受标准可分为两个部分：系统适用性要求和检测数据要求。系统适用性是试验进行的基本条件，虽然有些企业在可接受标准中没有明确写出，但可以确定6家企业在系统适用性上的可接受标准是一致的。

对于数据检测要求，根据数据来源可以分为两类：一类使用RSD制定标准，6家企业中仅有KL使用；一类使用检测结果的差值，除KL外的5家企业均使用该方式。

使用RSD制定标准时，对数据的数量有一定的要求，最少需要5个平行数据，以5个以上为佳，在耐用性验证时，比较的是方法改变前后的数据差异，数据数量一般为2或4，此时计算这些数据的RSD是不太合适的。

因耐用性验证的目的是考察测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，故重点应该是影响程度，使用测定值与标准条件测定值的差值来进行判断，显然比较符合耐用性验证的目的。

在含量测定的耐用性验证中，除KL外的5家企业均采用测定值与标准条件测定值的差值≤2.0%（等同于98.0%~102.0%）作为可接受标准，其中AY增加了超出范围后的处理方式，相对来说可接受标准制定得更完善。

在有关物质测定的耐用性验证中，KL仍然采用RSD作为可接受标准，HR和FD均采用有关物质数据相对参比结果的偏差均≤10%（等同于90.0%~110.0%）作为可接受标准，剩余3家企业均采用分段式限度标准作为可接受标准。显然采用RSD仍存在适用性不佳的问题，在此主要比较后两种方式的优缺点。

有关物质检测具有一定的特殊性，杂质含量限度一般在5%以下，大部分限度在1.0%以下，而杂质含量实测值就更低了，若一个杂质测定值小于0.1%，显然很难做到偏差≤10%的要求，故在有关物质耐用性验证上选择一刀切是脱离实际的。

虽然CRO、HZ和AY均采用分段式限度标准作为可接受标准，但还是存在一些区别。其中CRO和AY可以认为是完全一致，仅在数位上存在微小差异；HZ与其他两家企业相比，在不进行比较的数据选择上增加了X＜LOQ，在0.05%≤X＜0.10%区间，标准设定为均在此范围内，在0.10%≤X＜0.50%和0.50%≤X区间的标准设定上，均选在了不包含等于。

两种标准的设定上均不存在明显缺陷，且从本质上讲，标准设定的出发点也是一致的，在0.05%≤X＜0.10%时，结果差值≤0.05%与均在此范围内是等效的。故可以认为CRO、HZ和AY采用的限度制定方法是一致的。

综合上述分析，我们可以总结出一个适用性较广的验证方法和可接受标准，用于液相色谱法耐用性项目的方法验证，验证方法和数据要求见表6。

表6  液相色谱法中典型变动因素下耐用性的验证方法和数据要求