[技术探析] 解码抗体-寡核苷酸偶联：探索siRNA与PMO AOC在药物开发中的生物偶联策略

图1：抗体与siRNA偶联物的构效关系（图片来源：参考文献1）

抗体和寡核苷酸是生物医药领域中两类强大且多样化的分子，抗体能够高特异性识别并高亲和地结合多种细胞表面靶标，因此已被广泛应用于治疗和药物递送中，比如近几年来如火如荼的抗体药物偶联物（ADC），但其本身对于细胞内药物靶点则力有不逮；反观寡核苷酸（如小干扰RNA/siRNA，反义寡核苷酸/ASO和磷酰二胺吗啉寡聚物/PMO）则是通过调控基因表达，包括mRNA降解、剪接调控以及外显子跳跃，在多种疾病治疗中展现出了良好效果。在过去25年间，已有超过16种寡核苷酸药物获批(参考文献2)，为疾病治疗提供了新的选择。

图2：天然DNA和RNA以及一些已获批并用于治疗的相关化学修饰（图片来源：参考文献2）

该研究探索了抗体-siRNA偶联物（AOC）的偶联策略，涉及的偶联方案包括使用部分还原抗体链间二硫键暴露半胱氨酸(Cys)巯基，使其与siRNA连接子-马来酰亚胺偶联，生成DAR1的抗体-siRNA偶联物。此外，文章还探讨了在抗体的Asn297和赖氨酸(Lys)位点进行偶联的策略，结果显示通过Cys偶联的AOC表现出更好的血浆稳定性。另外，作者还比较了链间随机Cys偶联与thiomAb定点Cys偶联的DAR1 AOC的血浆稳定性，结果表明二者具有相似的血浆稳定性（见图3）。虽然随机链间Cys具有不用抗体改造的优势，但是其也存在抗体还原后游离Cys可能导致的聚集和二硫键重排问题。为了解决这一问题，作者在还原后采用DHAA（脱氢抗坏血酸）氧化和NEM （N-乙基马来酰亚胺）封端处理，确保DAR1偶联物的稳定性。结果表明，NEM封端有效消除了游离Cys，确保AOC在储存期间不会形成二聚体。这一优化策略在不同抗体上表现略有差异，但游离Cys封端处理具有广泛适用性。

图3: 不同偶联方式AOCs的血浆PK. (图片来源：参考文献1)

siRNA在体内给药后易受内外切酶降解，影响其在靶组织中的积累和持久性，通过化学修饰，如2′-F、2′-OMe、2′-MOE及硫代磷酸酯（P-S）替代，可以有效提升其稳定性。研究显示，通过将这些修饰应用于siRNA，可以显著改善其在肌肉组织中的稳定性和药效，尤其是通过糖修饰（如UNA、LNA）和P-S的组合，可以实现长达8周的基因敲低效果(见图4)。

图4：不同化学修饰对siRNA AOC在小鼠中的稳定性及活性的影响（图片来源：参考文献1）

文章中，作者制备了DAR为1、2和3的siRNA AOC来研究DAR值对疗效的影响。结果显示，随着DAR的增加，AOC的血浆清除率加快（见图5.a&b)，特别是DAR2的清除速度约为DAR1的五倍，这主要是由于肝脏的非生产性摄取（Nonproductive uptake）增加，导致肌肉中的药物输送和活性的降低，更高的DAR还会改变偶联物的物理化学性质，如尺寸和负电荷密度的变化，影响与血浆蛋白的相互作用。对于PMO AOC，较高的DAR（如DAR9.7）在降低抗体剂量的情况下，依然能够有效递送相同量的PMO，并显著提高了心脏中的外显子跳跃效果（见图5.e)，这表明在不同应用中，DAR的优化对于提高AOC疗效、生产效率和成本效益都具有重要意义。

图5: 不同DAR值AOC在小鼠血浆的PK(a & b) (图片来源：参考文献1)；不同DAR值AOC (PMO)对心肌细胞中外显子跳跃的影响（图片来源：参考文献3）

该研究探讨了可裂解和不可裂解连接子对AOC药代动力学和疗效的影响，通过对比多种连接子，发现虽然连接子在siRNA血浆清除率上的影响不大，但优化连接子结构和空间位阻（如增加双甲基基团）可以提高其在循环中的稳定性，从而减慢AOC的清除速度（见图6）。在PMO AOC的研究中（参考文献3），不同连接子在药效上的差异较小，这说明了连接子的影响具有一定的局限性。

图 6：含有不同可裂解连接子的AOC在小鼠血浆中的PK（参考文献1）

研究还探讨了连接子在siRNA连接位置对稳定性和敲低效率的影响，结果显示，连接子在siRNA的正义链的3′或5′端对不同组织（如肌肉、心脏、肝脏和肺）的mRNA敲低效果无显著影响。然而，当连接子位于正义链的骨架中间（如第8位或第14位）时，低剂量下敲低效率下降，表明这些位置可能干扰RISC装载。相比之下，5′端连接子在肝脏和肌肉中的敲低效果优于中间位置的连接子（见图7）。此外，当剂量超过1 mg/kg时，siRNA浓度升高并未进一步提高敲低效率，提示其他因素如细胞类型和递送机制对疗效有影响。

图7：连接子位于siRNA不同部位对AOC在肝脏中对相关基因敲低效果的影响 （图片来源：参考文献1）

在PMO AOC的研究中则比较了PMO在3′端和5′端的接头位置对外显子跳跃效力的影响（见图8），结果表明，尽管差异不大，3′端接头的PMO外显子跳跃效力略优于5′端接头的PMO。虽然5′端接头的PMO在组织中浓度稍高，但其效力较低，可能是由于5′端接头体积较大影响了其进入细胞核与目标前mRNA（pre-mRNA）结合的能力。

图8：PMO偶联位点对外显子跳跃效率的影响（图片来源：参考文献3）

本研究还探讨了PEG对siRNA AOC活性和药代动力学的影响，PEG可以提高分子溶解度、减少非特异性蛋白结合、提供保护以减少酶的作用从而减少清除率。对比PEG位于siRNA内部或外部的AOC，PEG位置或大小对血浆PK无显著影响，但将PEG放置在siRNA外部提高了基因敲低效果并增加了肿瘤中的组织浓度，这表明PEG能增强siRNA的稳定性和亲水性（见图9a）。此外，PEG化的AOC在较低剂量下达到了与无PEG AOC更高剂量相似的组织浓度和敲低效果（见图9b）。

图9：PEG修饰对基因敲降效果的影响（图片来源：参考文献1）

研究探讨了siRNA偶联在多种亚型抗体中的适用性（见表1），结果显示，不同抗体亚型在siRNA偶联效率及DAR分布上存在差异，尤其是hIgG4生成的主要是DAR2。不同连接子的使用（如MCC和BisMal）也会影响DAR分布，尽管各抗体亚型的DAR1产率不同，但通过优化都可以获得足够的纯DAR1用于临床前研究。

表1：各种 mAb 亚型的偶联反应条件和 DAR 分布总结 （图表来源：参考文献1）

下表中，我们总结了PMO AOC与siRNA AOC的结构活性关系（SAR）对比表，以帮助读者快速阅读：

AOC策略为克服寡核苷酸药物递送障碍提供了新的思路，通过结合抗体的靶向性和寡核苷酸的基因调控功能，能够有效提升药物疗效和稳定性。未来，随着构效关系研究的进一步深入，AOC有望在基因治疗领域发挥更大的作用。

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参考文献/资料：

1. Cochran M, et al. Structure-Activity Relationship of Antibody-Oligonucleotide Conjugates: Evaluating Bioconjugation Strategies for Antibody-siRNA Conjugates for Drug Development. J Med Chem. 2024 Sep 12;67(17):14852-14867.

2. Egli M, Manoharan M. Chemistry, structure and function of approved oligonucleotide therapeutics. Nucleic Acids Res. 2023 Apr 11;51(6):2529-2573.

3. Cochran M, et al. Structure-Activity Relationship of Antibody-Oligonucleotide Conjugates: Evaluating Bioconjugation Strategies for Antibody-Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer Conjugates for Drug Development. J Med Chem. 2024 Sep 12;67(17):14868-14884.