1.CUT技术的前世今生
2017年1月，来自美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff 团队，使用微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease）MNase进行染色质切割，替代了ChIP-seq中的超声打断，开发了CUT&RUN技术。(Skene et al., 2017)
2018年4月，研究人员继续改进CUT&RUN，使用洋地黄皂苷（Digitonin）对细胞膜进行“打孔”，从而可以无需提前分离细胞核 (Skene et al., 2018)。
2. CUT&Tag问世
2019 年4月 Steven Henikoff 团队在 Nature Communications 杂志上发表了题为“CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells” 的论文，第一次提出了 CUT&Tag 方法。
这种方法用来研究蛋白质与DNA相互作用的技术，利用Tn5转座酶的特点，在切割染色质的同时直接插入接头，极大地缩减了建库时间，且对样本量要求更低，所需测序深度也更低。
Nature曾发文， 表示CUT&Tag是最具有发展前景的新技术之一，作者重点指出了 CUT&Tag技术有望揭示在胚胎发育的过程中，基因组结构和染色质修饰如何决定细胞命运。
3. CUT&Tag技术原理
用基因工程改造方法做出来的结合了ProteinA和Tn5转座酶这两种蛋白质的功能的融合蛋白是实验的核心。
在这个融合蛋白中ProteinA的部分是负责实验中的一抗和二抗结合，也就是负责把Tn5酶拉到目标蛋白质所吸附的染色质DNA位置附近。
Tn5的部分则执行转座酶的功能，切断附近的DNA链。并且这个Tn5酶是被事先结合好了标签DNA序列的，所以被Tn5酶切断的染色质DNA片段会被加上标签DNA序列，并且因为切下来的DNA片段两端已经带了标签DNA序列，它就很容易被PCR扩增，再进一步加上建库接头，成为后面深度测序的文库，被用于深度测序(Kaya-Okur et al., 2019)。
4. CUT&Tag实验流程
（1）利用刀豆素A包被的磁珠（ConA磁珠）与细胞结合，从而捕获细胞，刀豆蛋白A是一种凝集素，它可以粘住细胞，之所以实验中要用刀豆蛋白A的磁珠来粘住细胞，原因是在整个实验的多步反应中，要做多步的孵育和清洗，利用磁珠吸附细胞，可以使回收细胞的操作变得方便。
（2）细胞膜和核膜做通透化处理，透化的目的是让细胞膜和核膜产生小洞，这可以让后面要用到的酶和抗体等物质进入细胞核。
（3）加入针对目标蛋白的一抗，这个一抗会透过细胞膜和核膜进入细胞核，然后就可以结合在目标蛋白上。然后再加上二抗，二抗结合在一抗上，加入二抗的目的是为了放大信号。
（4）接下来，加入ProteinA和Tn5转座酶的融合蛋白，其中ProteinA结合到抗体上包括之前的一抗和二抗，这样目标蛋白结合到它识别的染色质DNA序列上，抗体结合到目标蛋白，ProteinA结合到抗体，ProteinA又连着Tn5酶，这样Tn5酶就出现在了被目标蛋白吸附的染色质DNA序列的旁边；
（5）再接下来加入Mg离子，Mg离子能够激活Tn5转座酶的酶活性，于是Tn5转座酶切断DNA链，并且在切断的DNA链的两端加上标签序列，最后把核酸抽提出来，对有标签序列的DNA片段进行PCR扩增，然后进行高通量测序(Kaya-Okur et al., 2019)。
5.ChIP-seq技术原理
首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
6. ChIP-seq实验流程
（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；
（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；
（3）设置分组：严格的ChIP实验包括三组，实验组以及两个对照（input-DNA和IgG-control），分别为阳性对照和阴性对照
（4）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；
（5）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；
（6）将准备好的文库进行高通量测序。
7. CUT&Tag与ChIP-seq优势对比
ChIP-Seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）因能真实、完整地反映靶蛋白与DNA序列的结合情况，因而成为研究DNA-蛋白相互作用的经典方法。但ChIP-Seq继承了ChIP的难点与局限性：需要大量细胞投入（100万左右），甲醛交联易导致假阳性或假阴性，整体实验步骤复杂耗时长，测序数据背景信号高等，这些难点使得研究变得较为困难。
与传统的ChIP-seq相比，CUT&Tag技术优势明显：
（1）无需免疫共沉淀和超声破碎，一般不需要甲醛交联，因此细胞起始量低；
（2）性价比高：背景噪音低、信噪比高，所需测序深度少；
（3）实验重复结果一致性好，peak-calling的效率更高；
（4）使用Tn5转座酶代替传统的超声打断，靶向性更强。
从测序结果来看，显示的是ChIP-seq/CUT&RUN/CUT&Tag三种方法得到蛋白与染色质结合峰的比较，第一行是ChIP-seq方法测序深度达到50M reads的时候，reads在这一段染色质上的覆盖情况，第二行还是ChIP-seq的方法，但是测序深度下调到8M reads的情况，第三行和第四行分别是CUT&RUN/CUT&Tag这两种方法测序深度，各测8M reads的情况，横轴是把这3M的染色质展开；
每张图中，峰的高低是覆盖在相应位置上resds数量的多少，一个位置覆盖的reads数目越多，峰越高，峰所在的位置也就是目标蛋白吸附的染色质的位置；
从图中可以看出，峰所在的染色质的位置是高度一致的，也就是说三种方法测到的蛋白质吸附的染色质位置是一致的，另一方面，当取8M reads的测序深度的时候，ChIP-seq方法的背景很高，ChIP-seq要把测序深度提高到50M reads，信号才能看得比较明显，而CUT&Tag在8M reads的时候背景信号已经很低，这说明CUT&Tag的信噪比要比ChIP-seq更高。
相关性热图表明，CUT&Tag的两个重复样品表现出更高的组内相关性；从peak calling可以看出，在测序数据量相同的情况下，CUT&Tag的peak Region内的数据量更多，信号更强。
8. 送样指南
新鲜细胞
（1）按照上述细胞数量要求转移适量细胞至1.5 mL离心管；
（2）使用封口膜封好离心管，用碎冰保持管周边温度在4℃左右，迅速送至公司。
冻存细胞
（1）根据计数结果，使用冻存液重悬细胞沉淀，因解冻过程有损失，故每个冻存管中要求细胞数量大于50,000-80,000个，数量以我司解冻后计数为准；
（2）把冻存管放到程序降温盒内，再把程序降温盒放到-80℃的冰箱里，以保护细胞不被损伤（无程序降温盒的老师可以用梯度降温流程代替）；
（3）-80℃降温24h 后，即可使用干冰运输。（细胞冻存液配方：90%胎牛血清+10%DMSO）
动物组织
（1）取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪等杂质；
（2）用预冷的 PBS 溶液漂洗，将组织表面的血渍冲洗干净；
（3）如果组织体积较大，将组织切成长宽高均≤0.5cm 的小块；
（4）将处理好的组织样本混合均匀后保存于 1.5ml 离心管中，每管 20mg-40mg 左右（每个样本分装 2 管）；
（5） 迅速置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存；
（6）为确保实验的顺利，建议样品备份 1-2 份，以防部分样品降解重新取材、制备或送样。
（7）运送方式：将冻存管置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰，进行运输。
植物组织
（1）从植物体上，取下新鲜组织。取材后需用清水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净，吸干；
（2）如果组织体积较大，应在冰上将组织剪切成小块或薄片，然后放入 1.5ml 离心管中，每管50mg 左右每个样本分装 2 管)，准确标记样品名称；
（3）迅速置于液氮速冻，然后转移至-80℃冰箱长期保存；
（4）为确保实验的顺利，建议样品备份 1-2 份。
注意事项
送样前，尤其寄送新鲜细胞时，请提前与销售人员沟通。
参考文献：
Skene, P., Henikoff, J. & Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006–1019 (2018).
Michael P Meers, Terri D Bryson, Jorja G Henikoff, Steven Henikoff (2019) Improved CUT&RUN chromatin profiling tools eLife 8:e46314
aya-Okur, H.S., Janssens, D.H., Henikoff, J.G. et al. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc 15, 3264–3283 (2020).
Kaya-Okur, H.S., Wu, S.J., Codomo, C.A. et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun 10, 1930 (2019).
Seven technologies to watch in 2023.PMID: 36690758 DOI: 10.1038/d41586-023-00178-y.
Methods for ChIP-seq analysis: A practical workflow and advanced applications .PMID: 32240773 DOI: 10.1016/j.ymeth.2020.03.005.
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