单细胞转录组测序揭示中性粒细胞抗癌新潜能- 大数跨境

Biolinker

2025-03-25

导语

中性粒细胞作为人体抵御病原体的重要防线，在癌症领域却展现出复杂且矛盾的特性。一方面，它能快速响应病原体，但在癌症中，其作用存在争议，既被认为具有免疫抑制性，又有研究表明可发挥抗癌作用。另一方面，由于中性粒细胞半衰期短（仅 6 - 8 小时）、mRNA 含量低，现有研究对其转录多样性和时空异质性的了解十分有限。在癌症免疫研究中，中性粒细胞究竟是抑制还是保护机体尚未明确，这种不确定性促使科研人员运用单细胞分析技术，试图系统解码肿瘤浸润中性粒细胞的细胞多样性，明确其基因表达模式和生态位框架，从而为癌症治疗开辟新路径。

2025年3月作者在期刊Cell（中科院1区 IF：64.5）上发表了题为“Neutrophil profiling illuminates anti-tumor antigen-presenting potency”的文章，通过单细胞转录组测序，绘制了癌症中性粒细胞图谱，揭示了中性粒细胞的异质性和抗肿瘤抗原呈递潜能，为癌症免疫治疗提供了新的策略和潜在靶点。

实验设计

1.样本采集：收集复旦大学附属中山医院 143 例患者，17种癌症类型，225 个样本，包括原发和转移样本、配对的正常组织及血液样本。

2.细胞分选：用胶原酶 IV 和透明质酸酶在 RPMI 1640 培养基中消化肿瘤样本，经400 μm滤网过滤、洗涤后，进行中性粒细胞分选。

3.测序：对分选出的179,908个中性粒细胞进行 10x Chromium 单细胞转录组测序。

主要结果

1.展示了癌症中性粒细胞图谱的生成及中性粒细胞的转录特征

作者通过分析 TCGA 数据库中 31 种实体癌的 8766 个样本，发现中性粒细胞浸润具有组织选择性，可分为3种亚型，且在炎症或纤维化抑制性肿瘤微环境中浸润更明显。基于此，作者对 225 个样本进行单细胞 RNA 测序，生成中性粒细胞图谱。进一步聚类分析发现中性粒细胞存在 10 种不同状态，各状态具有独特的基因表达特征和富集通路，包括炎症、血管生成和抗原呈递等相关特征，该图谱不仅涵盖已知中性粒细胞亚群特征，还揭示了潜在的未被表征的亚群。

Figure 1 The generation of a pan-cancer single neutrophil atlas

2.中性粒细胞的分子特征和生存相关性分析

通过计算树结构和 Ro/e 分析，发现 HLA - DR⁺CD74⁺和 VEGFA⁺SPP1⁺中性粒细胞是癌症中富集的亚群，但在不同癌症类型中的浸润存在偏好，如前者在非小细胞肺癌、膀胱癌和卵巢癌中富集，后者在肾细胞癌和胃腺癌中更为常见，这一结果得到了流式细胞术和多重免疫组化的验证。对患者生存分析显示，VEGFA⁺SPP1⁺亚群与最差的患者预后相关，而 HLA - DR⁺则与最佳预后相关。

此外，不同中性粒细胞亚群的细胞因子、MHC 分子表达和免疫表型存在显著差异，HLA - DR⁺CD74⁺中性粒细胞高表达 CCL5 和 MHC II 类分子，利于招募 T 细胞；IFIT1⁺ISG15⁺中性粒细胞高表达 PD - L1，具有免疫抑制作用。同时，研究还发现肿瘤相关中性粒细胞大多处于成熟状态，且不同时间采样的中性粒细胞在成熟和趋化水平上存在差异，部分中性粒细胞亚群在癌症和炎症条件下的分布也有所不同，揭示了肿瘤微环境对中性粒细胞状态的影响。

Figure 2 Molecular features and survival correlation of neutrophils

3. HLA-DR⁺中性粒细胞的特性分析

运用多种算法分析发现，HLA-DR⁺CD74⁺中性粒细胞在中性粒细胞分化进程中处于终端位置，通过对 24 例 8 种癌症患者肿瘤内中性粒细胞的流式细胞术以及多癌种 TMA 队列的 mIHC 检测，证实其成熟标记物 CD11b、CD16 和 MPO 表达显著更高，转录因子 RFX5 在该亚群中特异性激活。在代谢方面，HLA-DR⁺中性粒细胞在氨基酸代谢（如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）显著富集，与免疫抑制性的 VEGFA⁺SPP1⁺中性粒细胞在维生素和聚糖代谢占优势形成对比。这些结果表明 HLA-DR⁺中性粒细胞是终末成熟的亚群，且肿瘤中性粒细胞的代谢存在协调性，为后续探究其功能及机制奠定基础。

Figure 3 HLA-DR neutrophils are terminally differentiated and metabolically reprogrammed+

4.探究亮氨酸对中性粒细胞抗原呈递功能的调控机制

体外实验表明，亮氨酸可上调 HLA-DR 及共刺激分子（如 CD80）表达，促进 MHC-II 相关基因表达，增强抗原呈递过程。亮氨酸处理使细胞内亮氨酸水平上升，通过代谢组学分析发现其改变了 ATP 和脂肪酸生成，引起线粒体聚集、形态改变，增强线粒体呼吸，且依赖于线粒体呼吸来调节 HLA-DR 表达。进一步研究发现，亮氨酸经代谢生成乙酰 - CoA，激活 H3K27ac 修饰，特异性地增强 MHC-II 基因位点的 H3K27ac 修饰，提升其染色质可及性，从而激活 MHC-II 基因转录。总之，亮氨酸通过代谢-表观遗传调控轴（乙酰-CoA/H3K27ac/MHC-II）启动中性粒细胞抗原呈递机制。

Figure 4 Leucine primes HLA-DR neutrophil generation through metabolic-epigenetic regulation+

5. HLA-DR⁺中性粒细胞与 T 细胞的相互作用分析

通过对匹配肿瘤样本的批量 RNA 测序及免疫细胞比例聚类分析，发现 HLA-DR⁺中性粒细胞与多种抗肿瘤 T 细胞亚群在空间上共定位，尤其在肾细胞癌、卵巢癌和结直肠癌样本中，CD8⁺ T 细胞与 HLA-DR⁺中性粒细胞的共定位现象明显。体外共培养实验表明，HLA-DR⁺中性粒细胞能促进 T 细胞表达 TNFα，引发抗原特异性和非特异性 T 细胞反应，激活 T 细胞的细胞毒性，且该过程主要通过直接的配体 - 受体相互作用，ICAM1 可能是关键配体。此外，用突变衍生的新抗原刺激 HLA-DR⁺中性粒细胞后与 T 细胞共培养，可观察到 T 细胞的反应，测序发现 T 细胞受体（TCR）发生重排，进一步证实 HLA-DR⁺中性粒细胞可有效激活 T 细胞反应，在肿瘤免疫中发挥重要作用。

Figure 5 HLA-DR neutrophils and related T cell responses+

6.探究抗原呈递中性粒细胞在体内的作用及相关机制

研究收集 7 种小鼠癌症类型的 scRNA-seq 数据，发现小鼠肿瘤微环境中存在与人类相似的中性粒细胞亚群，且Cd74⁺亚群具有抗原呈递功能。体外实验显示，亮氨酸可刺激小鼠循环中性粒细胞上调Cd74、Cd80和Cd86表达，但在缺乏亮氨酸转运体或代谢酶的基因敲除小鼠中，这种上调作用消失。在体内实验中，MHC-II flox/flox Ly6G Cre-tdTomato 小鼠（特异性缺失抗原呈递中性粒细胞）接种肿瘤细胞后，肿瘤生长加快，肿瘤内 Cd4⁺和 Cd8⁺ T 细胞浸润显著减少；而给予小鼠亮氨酸丰富饮食后，肿瘤内 Cd74⁺中性粒细胞增多，T细胞浸润增加，但短期内对肿瘤体积和体重无明显影响。scRNA-seq分析表明，亮氨酸饮食可改变肿瘤微环境，激活相关信号通路。这些结果表明，抗原呈递中性粒细胞在体内对肿瘤生长和 T 细胞浸润有重要影响，亮氨酸饮食具有潜在的治疗价值。

Figure 6 Correlation between antigen-presenting neutrophils and associated in vivo immunophenotypes

7.探究抗原呈递中性粒细胞在免疫治疗中的作用

在小鼠肿瘤模型实验中，亮氨酸饮食联合抗 PD-1 疗法能显著减小肿瘤体积，使部分肿瘤达到稳定状态；单独输注经亮氨酸刺激的 Cd74⁺中性粒细胞也可减小肿瘤大小，但效果不如联合治疗，且敲除 Cd74 的中性粒细胞治疗效果明显减弱。将抗 PD-1 抗体与 Cd74⁺中性粒细胞输注联合，在多种肿瘤模型中展现出强大的抗肿瘤效果，部分肿瘤甚至完全缓解。在临床免疫治疗数据分析中，8 个接受免疫治疗的队列显示，HLA-DR⁺中性粒细胞特征与患者更好的生存或治疗反应呈显著正相关。在患者来源的肿瘤片段模型中，抗原呈递中性粒细胞与 PD-1 抗体联合，可显著增强 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞的反应性和细胞毒性。综上，抗原呈递中性粒细胞在免疫治疗中具有协同增效作用，为癌症治疗提供了新的策略和方向。

Figure 7 Examination of the therapeutic value of antigen-presenting neutrophils

小结

作者通过对17 种癌症类型的 225 个样本进行单细胞 RNA 测序分析，全面描绘了肿瘤中中性粒细胞的复杂景观。研究发现中性粒细胞存在 10 种不同状态，具有显著的组织和表型可塑性，其中抗原呈递状态的中性粒细胞与患者较好的生存相关。亮氨酸可通过代谢-表观遗传调控机制激活中性粒细胞的抗原呈递程序，增强 T 细胞对（新）抗原的反应。在小鼠模型中，递送抗原呈递中性粒细胞或给予亮氨酸饮食能调节肿瘤免疫微环境，增强抗 PD - 1 治疗的效果。临床样本分析也证实了抗原呈递中性粒细胞在免疫治疗中的积极作用。该研究揭示了中性粒细胞在癌症中的多样性和功能可塑性，为基于中性粒细胞的癌症免疫治疗提供了新的策略和潜在靶点，但仍需进一步研究来明确部分机制和潜在副作用。