导语
水牛(Bubalus bubalis)是热带和亚热带地区重要的经济动物，但其繁殖能力较低，极大地限制了水牛产业的发展。
体外胚胎生产(In vitro embryo production，IVEP)和体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)等胚胎生物技术可以加速水牛种群的遗传育种，促进水牛产业的发展。
然而，低囊胚发育率(Low blastocyst development rates，26.5%-39.48%)阻碍了其广泛应用。因此，阐明水牛早期胚胎发育规律及胚胎基因组激活(Embryonic genome activation，EGA)分子调控机制具有重要意义。
2023年7月石德顺研究员团队在国际期刊Journal of Animal Science and Biotechnology(7.0/Q1)发表了题为“Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in bufaloes”的文章。
该研究通过RNA-seq和WGBS分析，绘制了水牛胚胎着床前发育(Pre-implantation embryonic development，PED)的转录和DNA甲基化的图谱，并深入揭示了水牛母源-合子转化(Maternal-tozygote transition，MZT)过程中EGA和遗传编程的分子机制，这将为改善水牛胚胎的体外发育奠定基础。
WGBS实验设计
样本类型：水牛卵母细胞和体外受精胚胎
样本采集：9个发育阶段，18个样本
测序策略：Illumina HiSeq X Ten，clean data平均84.15 Gb/样本
主要结果
一、水牛PED期间DNA甲基化景观的构建
作者分析了水牛PED中CpG甲基化的全局动态，并且检测了整个基因上DNA甲基化水平，发现在所有发育阶段都有类似的DNA甲基化趋势。
此外，低甲基化水平(0 ~ 20%)的CpG位点比例在16阶段为40.41%，显著高于其他阶段，表明16阶段是水牛胚胎MZT的关键转折点。
在16 阶段的差异甲基化区域(Differentially methylated regions，DMR)有9694个，显著高于4~8阶段的DMRs；由DNA甲基化导致的胚胎基因组转录抑制可以通过DNA去甲基化来缓解，随后胚胎基因组激活(EGA)迅速启动。
为了进一步了解DNA甲基化如何调节基因表达，作者研究了水牛PED期间DNA甲基化与基因表达的关系，发现启动子区域的DNA甲基化水平与相应基因的表达水平呈负相关。
因此，基因的高表达水平对应启动子区域低甲基化水平和在整个基因区域高甲基化水平。验证了胚胎基因组的表达与DNA甲基化水平呈负相关，尤其是启动子的表达，启动子的激活受DNA甲基化水平的调控(Deng et al.,2020)。
Figure1.The DNA methylome landscape during buffalo PED
二、WGCNA鉴定阶段特异性共表达模块
WGCNA(Weighted gene co‑expression network analysis, 加权基因共表达网络分析)是为了揭示水牛PED期间基因共表达模式的动态和全基因组水平的调控机制。
作者共鉴定了20个共表达模块，并构建了模块的聚类树状图；其次作者发现粉红色、浅青色和灰色三个模块与16阶段有显著相关性；
结果表明，在16阶段之前，一个严格和连续的程序对于水牛EGA是必要的，分子功能的逐步定时激活对水牛胚胎发育过程至关重要。
作者通过转录组和DNA甲基化分析，揭示了水牛早期胚胎发生过程中一系列有序的发育过程，整个发育阶段分为卵母细胞成熟(从GV卵母细胞到MII卵母细胞)、母体基因组依赖(从受精卵到8阶段)、EGA(16阶段)和胚胎基因组依赖(从桑葚胚到囊胚)四个阶段；
水牛胚胎基因组的基因转录和翻译同时发生在16阶段，这是水牛早期胚胎发生过程中转录调控最关键的过渡时期。
Figure2.Gene co-expression analysis of stage-specific dynamics by WGCNA
三、水牛EGA的遗传程序动态
为了进一步揭示水牛EGA基因调控网络的顺序发育过程，作者进行功能富集分析。发现16阶段富集内质网蛋白加工、蛋白输出、剪接体、RNA转运和RNA降解等通路；
这些信号通路的全基因组激活时间表明，受精后与MZT相关的各种关键信号通路相继被激活，EGA相关的细胞周期转变、母体mRNA降解、泛素介导的蛋白水解和翻译起始等生物学过程按照特定的时间顺序逐渐发生。
Figure3. Enriched pathway at the 16-cell stage and the dynamics of the important KEGG pathways
四、鉴定关键hub基因
作者对各胚胎发育阶段前10个hub基因进行cytoHubba分析，挖掘出一些在细胞周期、细胞存活和增殖、翻译、有丝分裂和mRNA衰变等方面发挥关键作用的关键基因，包括CDK1、AKT1、EIF2S1、CDH1和SMG1。
值得注意的是，在8-16阶段CDK1被确定为最重要的基因之一，CDK1主要通过细胞周期、间隙连接、细胞衰老和p53信号通路参与到水牛EGA的调控。卵母细胞受精后，CDK1及相关hub基因的表达开始上调，通过调节细胞周期为水牛EGA的发生做准备。
Figure 4. Identifcation of the key hub genes during MZT
Figure 5. Expression heatmap of enriched biological processes of CDK1
总结
综上所述，在该研究中作者利用RNA-seq和WGBS技术对水牛卵母细胞和着床前胚胎的整体转录组和DNA甲基化进行了测序。
绘制出水牛胚胎发生过程基因组转录和DNA甲基化图谱。基于基因表达和DNA甲基化变化的动态特征，证实水牛EGA主要发生在胚胎发育的16阶段。
在水牛MZT过程中，关键基因和信号通路的顺序激活是水牛EGA和水牛PED遗传编程的必要条件。该研究将为进一步了解水牛胚胎发育的分子机制提供重要的信息，并为改善水牛胚胎的体外发育奠定了基础。
参考文献
Deng M, Zhang G, Cai Y, Liu Z, Zhang Y, Meng F, et al. DNA methylation dynamics during zygotic genome activation in goat. Theriogenology. 2020;156:144–54
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