导语
癌症是全球死亡的主要原因之一，癌症疼痛严重影响患者的生活质量且其致病机制尚不清楚。目前认为疼痛部分是由肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的炎症引发，但慢性炎症如何驱动癌症并发症尤其是慢性疼痛的机制尚不清楚。越来越多证据表明非神经元细胞在疼痛调节中有重要作用，如巨噬细胞和癌细胞，然而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）在癌症疼痛中的功能和调控机制在很大程度上仍然未知。
2022年有研究团队在Science Advance（IF=11.7）期刊上发表了题为“Single-cell RNA sequencing uncovers a neuron-like macrophage subset associated with cancer pain”的文章。本研究旨在探究TAM如何促进肿瘤神经支配，以寻找癌症疼痛治疗新靶点。
研究方法
1.样本：取LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠的肺癌肿瘤制备单细胞悬液，之后通过荧光激活细胞分选获得tdTomato+细胞
2.单细胞捕获平台：10X Genomics
3.研究思路：首先通过流式分选从小鼠的肿瘤中筛出巨噬细胞进行单细胞转录组测序，发现了一个高表达神经相关基因的未知巨噬细胞亚群。接着证明了巨噬细胞向类神经元细胞转化（macrophage to neuron-like cell transition，MNT）现象是真实存在的，可能与肿瘤疼痛直接相关。最后发现Smad3在MNT中发挥至关重要的作用，并提出Smad3可能是针对肿瘤中MNT驱动的神经发生的一个可用药靶点。
主要研究结果
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发现未知的神经元样TAM亚群
研究人员在巨噬细胞谱系中发现了一个高表达神经元分化标志物TUBB3的TAM亚群，Shank、Map1b、Syt13、Cyb5d2、Pax6、Cdon、Wnt5a和Pex2等与神经相关的基因也在该亚群上表达。用双光子实时成像证明肺癌肿瘤中存在这个亚群，最后通过小鼠行为实验证明TUBB3+TAM的存在与癌症相关的伤害性行为高度相关，这表明TUBB3+TAM亚群可能与肿瘤疼痛直接相关。
Figure 1 Macrophage-specific scRNA-seq reveals a previously unknown neuron-like TAM subset
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神经元样TAM亚群与非小细胞肺癌的神经发生有关
研究人员在人类非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer，NSCLC）中发现了TUBB3+CD68 TAM的存在，该亚群显示出与TUBB3+TAM亚群相似的转录组特征。通过流式细胞术分析，发现TUBB3+TAM亚群在非小细胞肺癌中高度聚集，并与人类TME中神经元分化标志物TUBB3的表达呈正相关。此外，研究人员还发现TUBB3+CD68+ TAMs上调的差异基因与神经元疾病高度相关，这提示新发现的TAM亚群可能对神经发生有潜在作用。
Figure 2 Presence of the neuron-like TAM subset in NSCLC
3
TME中巨噬细胞向神经元样细胞转化
RNA速率分析的结果表明高表达TUBB3的簇来自表达CD68和ADGRE1的簇，单细胞轨迹分析也支持这一结果。通过共聚焦成像在LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠的肺癌肿瘤中观察到巨噬细胞谱系来源的Tubb3+细胞，占流式细胞术和图像分析检测到的肿瘤Tubb3+细胞总数的90%以上。这些结果证明了MNT现象的存在，提示它可能是一个神经元样细胞来源，可以直接促进肿瘤神经支配。
Figure 3 MNT in TME
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MNTs在体外显示神经元表型和活性
为了确定这个以前未知的TAM亚群是否参与肿瘤神经支配，研究人员在LysM-Cre/iDTR小鼠中进行了巨噬细胞耗竭实验。结果发现巨噬细胞耗竭后Tubb3 +TAMs显著减少，但在体内过继转移BMDM后Tubb3 +TAMs又增加。此外，研究人员通过将体外产生的BMDM来源的MNT转移到巨噬细胞功能障碍的小鼠体内，发现局部过继转移MNT可显著增强小鼠的伤害性反应。并且在单细胞数据中也发现MNT会特异性表达疼痛相关受体，如Ano1和Trpc1。这些结果表明MNT在肿瘤中可能表现出伤害性感受器样活性，这可能是癌症疼痛的潜在治疗靶点。
Figure 4 Neuronal phenotypes and activity of MNTs
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Smad3对MNT的发展至关重要
通过共聚焦显微镜发现非小细胞肺癌活检组织中人MNT细胞中Smad3的过度激活，多重免疫组织化学染色的结果发现巨噬细胞特异性Smad3与人非小细胞肺癌中MNT丰度之间存在相关性。在Smad3基因敲除的小鼠中，MNT及肿瘤相关的侵袭行为均受到很大程度的抑制。体外实验中，Smad3缺失可显著抑制LLC-CM诱导的WT BMDM中神经元标志物的表达，这些结果表明Smad3在MNT中发挥重要作用。
Figure 5 Smad3 is essential for MNT formation in the TME
6
抑制Smad3阻断MNT介导的实验性肺癌神经发生
ChIP-PCR的结果表明TGF-β1在体外会促进Smad3与Tubb3基因的5’非翻译区直接结合，提示Smad3在TGF-β1驱动的神经发生中起调控作用。随后，研究人员进行了ChIPseq，在总共212个直接靶基因中确定了7个神经元分化和12个神经系统发育相关的基因，揭示了Smad3在MNT介导的神经发生中的致病作用。之后用特异性抑制剂SIS3可以有效地阻断了MNT以及相关的肿瘤神经支配和荷瘤小鼠的癌症相关自发侵袭行为。因此，Smad3可能是针对肿瘤中MNT驱动的神经发生的一个可用药靶点。
Figure 6 Targeting Smad3 effectively blocks MNT-driven neurogenesis in vivo
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