Cell Discovery | 单细胞测序助力转移性结膜黑色素瘤研究

结膜黑色素瘤（conjunctival melanoman，CoM）是一种严重威胁视力和生命的恶性肿瘤。由于其来源难以区分、对肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）缺乏了解，即使接受标准治疗后转移死亡率仍然很高。因此，有必要揭示CoM的TME特征，探索其在肿瘤发生中的机制，为CoM的治疗策略提供理论基础。

2024年6月有研究团队在Cell Discovery（IF=13.0）期刊上发表了题为“Single-cell sequencing depicts tumor architecture and empowers clinical decision in metastatic conjunctival melanoma”的文章。本研究揭示了CoM肿瘤发生和进展过程中TME的景观和异质性，以期为临床治疗提供依据。

1.      样本：收集了10个样本进行单细胞测序，包括3个正常结膜样本和7个CoM样本；收集了13个良性结膜病变、18个原发性CoM病变和2个远端转移性病灶样本进行免疫荧光染色来验证蛋白质表达水平；收集了10个CoM样本进行空间蛋白质组分析。

2.      细胞数量：共获得47,017个细胞

3.单细胞捕获平台：10X Genomics

研究流程图和样本情况

主要结果

研究人员共鉴定出10种细胞，包括黑素细胞/黑色素瘤细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞。之后根据随访情况将CoM患者的分为稳定肿瘤组（ST组）和远处转移性肿瘤组（DMT组），2个组中的细胞类型一致，但细胞比例具有显著的异质性。

Figure 1 Diversity of cell types in CoM and nonmalignant conjunctival samples annotated by scRNA-seq.

对3041个非恶性黑色素细胞和11964个黑色素瘤细胞进行单细胞轨迹分析，根据转录状态可以分为3个簇。2个细胞谱系均起源于共同的祖细胞，之后一种谱系分化为黑色素瘤细胞，另一种谱系分化为黑色素细胞。同时发现黑色素瘤细胞中的基因主要是激活一些功能通路，包括细胞粘附通路、免疫反应信号通路和黑素体组织信号通路。这一结果在免疫荧光染色的中得到了验证，恶性结膜黑色素瘤样本中这些标志基因的表达升高。

Figure 2 Differential gene expression signatures reveal triggers for tumorigenesis and metastasis of CoM.

基质成纤维细胞是TME的重要组成部分，有助于肿瘤进展以及免疫治疗耐药性。研究中将将基质成纤维细胞分为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）和肌成纤维细胞，DMT组中的CAF高于ST组，这表明CAF可能具有致癌作用。研究还发现一些与血管生成的基因在CAF中高表达，并且显著富集到与血管生成相关的信号通路。Matrigel管形成试验的结果表明CAF增强了人脐静脉内皮细胞的管形成能力，推测CAF可以促进血管生成并形成纤维血管微环境，这两者都对肿瘤进展起着积极作用。

Figure 3 Transcriptomic features of CAFs indicate their potential role in promoting distant metastasis by enhancing angiogenesis.

为了分析肿瘤免疫微环境，研究人员对免疫细胞进行聚类，包括T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞和浆细胞。ST组和DMT组间的细胞比例存在很大的异质性，DMT组中B细胞和T细胞浸润水平均低于ST组，特别是CD8⁺T细胞。为了进一步分析T细胞的异质性，将其分为9个亚群，CD8⁺T细胞在ST和DMT组中表现出不同的转录组图谱。在DMT组中的下调的基因主要与抗原加工和呈递、T细胞分化和自身免疫性疾病相关。这些结果表明远端转移性CoM中CD8⁺T细胞浸润水平降低，进而导致远端转移性CoM中的免疫环境相对不活跃。

Figure 4 scRNA-seq profiling of the tumor immune microenvironment in CoM.

将CD8⁺T细胞分成5个亚群，CD8⁺幼稚T细胞的细胞比例显著升高。之后将CD8⁺T细胞分离，发现DMT组中大多数CD8⁺T细胞亚群的浸润水平低于ST组，如CD8⁺效应T细胞和CD8⁺记忆T细胞。之后对10个FFPE组织切片（CoM样本）进行了空间蛋白质组学分析，共定量了3514种蛋白质。研究发现DMT样本表现出血管生成能力增强，CAF标记物表达增加，肌成纤维细胞标记物表达减少，功能性T细胞标记物表达减少。这些发现与转移性CoM的TME内观察到的CAF介导的血管生成和功能失调的T细胞增加相一致。

Figure 5 CD8⁺ T cells play crucial roles in the distinctive immune microenvironment of distant metastatic CoM.