RNA-seq和ATAC-seq联合分析揭示小鼠体节成熟的转录和调控图谱

脊椎动物身体的形成依赖于中胚层的节律性分割形成体节，这是一个基本且保守的过程，体节是神经两侧的瞬时胚胎结构，进一步发育形成脊椎、相关骨骼肌、神经和血管等结构。时钟和波前模型解释了体节分割过程的控制机制，涉及转录振荡基因波（分子钟）和胚胎轴上的拮抗信号梯度（波前），分子钟由Notch、Wnt和成纤维细胞生长因子（FGF）等信号通路的基因组成，波前涉及Wnt和FGF信号的后向梯度与体节分泌的视黄酸（Retinoic Acid，RA）的反向梯度相互作用。有一些研究表征过体节发生过程中的基因表达模式，但这些研究都集中在前体节中胚层（Presomitic Mesoderm，PSM），缺乏对体节成熟过程中单个体节的转录和染色质变化的高分辨率研究。

2023年作者在期刊Developmental Cell（IF=10.7）上发表了题为“A transcriptional and regulatory map of mouse somite maturation”的文章。文中通过RNA-seq和ATAC-seq进行联合分析，绘制了体节成熟的转录和调控图谱，发现体节分化遵循保守程序且随发育加速，并受多种转录因子和调控模块控制，为哺乳动物体节发育的分子遗传学研究提供了依据 。

1.样本信息：C57BL/6J小鼠胚胎，收集6个不同的发育阶段以及8到35对体节的胚胎，每个体节对中的一个体节用于RNA-seq（n=76），另一个用于ATAC-seq（n=75）；

2.测序策略：Illumina HiSeq 4000，PE150。

1.体节成熟的高分辨率转录和调控图谱

作者通过分析不同轴向水平的体节表达基因，发现在不同胚胎阶段的体节在Hox基因的类别和表达水平上有明显差异，且仅Hox基因的表达就能根据观察到的体节阶段准确对样本进行排序。另外，根据在基因组中的位置对开放染色质区域进行分类，19%的Peak被视为启动子样元件，12%与基因外显子重叠，其余的Peak被注释为增强子样元件，其中24%为近端增强子，7%为远端增强子，1%为基因间增强子。

2.上皮体节在胚胎发育过程中采用共同的程序

首先作者通过对体节I、II、III在各发育阶段的比较，鉴定出大量差异表达基因，体节I和III差异最显著。这些基因在不同阶段表达动态和水平有差异，反映了体节成熟过程中的复杂调控，其中，下调基因与区域化和模式特化有关，上调基因与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）进展相关。另外分析了开放染色质变化，发现体节间有大量基因组区域可及性不同，富集于增强子样区域，表明调控主要通过远端元件。通过转录因子结合motif分析，发现多种调节因子参与，其结合位点可及性在体节成熟时有不同变化，如Hox蛋白结合位点可及性降低，C4锌指类受体可及性增加。

3.发育过程中的分子重塑调节体节对信号环境的反应

作者比较不同发育阶段体节的RNA-seq图谱，发现10,691个基因表达有显著变化。分析ATAC-seq数据，发现染色质景观广泛重塑，33,013个开放染色质区域显示出可及性的显著差异。与体节成熟过程中的变化不同，发育过程中更多差异可及位点在启动子或靠近差异表达基因处。另外，分析了RA信号相关的代谢物产生、转录因子活性和染色质动力学之间的复杂相互作用，发现参与RA产生的酶以及一些RA受体/转录因子在发育早期表达峰值较高，但此时其结合位点可及性最低，表明体节的表观遗传图谱从抑制状态转变为允许RA信号活动的状态。

染色质重塑集中在胸椎体节，超过一半的差异可及染色质位点在胸椎体节可及性最高，这些位点富集多种转录因子motif。并且观察到与细胞向肌源性谱系承诺相关的转录因子结合位点可及性增加，且先前研究表明年轻胚胎的体节激活标记基因表达所需时间更长，推测晚期发育中标记基因表达时间缩短是由于染色质景观的允许性变化。通过分析基因富集情况，发现颈椎或胸椎体节中活性最高的基因组位点与影响颈椎和胸椎及肋骨形态的表型相关，骶椎体节中活性区域与异常腰椎和骶椎相关，可用于识别对不同脊椎结构特化重要的基因和调控元件。

4.骨骼发生由相反的调控模块塑造

通过计算差异表达基因活性水平与100kb内开放染色质峰的相关性，识别出 12,803个潜在调控相互作用，涉及47%的差异表达基因。大多数（93.7%）与染色质变化显著关联的差异表达基因与1-5个潜在增强子区域相关，少数几百个基因与更多增强子相连，其中349个强连接基因包含控制体节发育和分化的关键因子，如Hox因子。作者通过聚类具有较大调控分数的转录因子，分为四个不同的调控活动模块。模块一：作用于体节三联体中表达有差异的基因，包括与前后模式建立和体节发生相关的基因，如Cdx1/2、Gbx2、Lef1和早期同源框组的Hox基因。CDX1、GBX2和SALL4对这些基因有较强调控分数，其表达在最不成熟体节I中最高。模块二：与发育过程中下调的基因相关，其活动受Shh信号影响。模块三和四：与发育进展中上调的基因相关。其中NR6A1在模块4中起突出作用，其结合位点在相关基因的Peak中高度富集，且与其他转录因子有拮抗作用。

文章对小鼠胚胎六个发育阶段的体节进行研究，通过RNA-seq和ATAC-seq分析发现体节分化随发育加速且遵循保守程序，发育过程中体节在转录、染色质等方面发生显著变化，涉及多种生物过程和信号通路，同时识别出众多调控相互作用和模块，包括早期和晚期活跃的相反程序，这些调控模块控制体节分化和骨骼发生，不同部位体节有不同分化特征且与基因相关，为哺乳动物体节发育的分子遗传学研究提供了重要依据。

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