导语
树鼩（Tupaia belangeri）是一种小型哺乳动物，寿命短，树鼩与灵长类动物之间的遗传相似性高于啮齿动物与灵长类动物之间的遗传相似性，尤其是与神经精神疾病和感染性疾病相关的基因，这为神经科学提供了一个有用的模型系统。
关于树鼩DNA甲基化等表观遗传机制的研究还很少，DNA甲基化在基因表达调控、神经精神疾病和X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）等调控过程中的重要作用。
2024年11月28日，该研究成果以“Whole-genome DNA methylomes of tree shrew brains reveal conserved and divergent roles of DNA methylation on sex chromosome regulation”为题发表在国际知名期刊《BMC Biology》上。在本研究中，作者绘制并分析了3只雄性和3只雌性树鼩前额叶皮层的全基因组DNA甲基化图谱。同时结合转录组数据，证明了DNA甲基化对基因表达的全基因组影响。揭示 DNA 甲基化在树鼩基因表达调控及 XCI 中的作用，进而为理解哺乳动物性染色体调控机制提供新信息。
一、实验设计
1.样品采集：采集雄性（n=3）和雌性（n=3）树鼩的大脑，解剖后取皮层组织，迅速用液氮冷冻并储存在 - 80°C。
2.RNA-seq：使用 Trizol 试剂从树鼩前额叶皮层（Prefrontal cortex，PFC）组织中提取总 RNA，评估 RNA 完整性。建库后进行文库质量评估，最后在 Illumina Novaseq 平台上进行测序，PE 150bp。
3.全基因组甲基化测序：采用酚 - 氯仿提取和乙醇沉淀法从 PFC 组织中提取基因组 DNA，进行重亚硫酸盐处理，PCR 扩增后进行产物纯化，最后在 Illumina NovaSeq6000 平台上进行测序。
二、主要结果
1. 树鼩基因组DNA甲基化
树鼩 PFC 中 CG 位点甲基化水平高，CH 位点低，启动子区域 CG 甲基化低于基因body且在 TSS 附近下降明显，非 CG 位点甲基化相对稳定。按表达水平分组后，发现基因在 TSS 附近均低甲基化，高表达基因 TSS 附近甲基化最低，基因表达与启动子甲基化负相关，基因body甲基化与表达关系为钟形负相关，低高表达基因甲基化低于中表达基因，这些结果与人类、小鼠研究有相似之处。
Figure1.DNA methylomes of tree shrew and the correlation between DNA methylation and gene expression.
2. 雌雄树鼩X染色体的差异DNA甲基化
与雄性相比，雌性树鼩 X 染色体在基因body和启动子区域的 DNA 甲基化水平显著较低，这种模式在整个 X 染色体上一致，且在不同功能区域以及非 CpG 甲基化中均存在，多数差异甲基化区域（DMRs）位于 X 染色体上。与常染色体对比表明，这是由于雌性 X 染色体的甲基化减少，即 “雌性低甲基化”。另外，雌性 X 连锁启动子的低甲基化程度与启动子区域内 CpG 的密度密切相关，低甲基化的启动子 CpG 数量较少，且随着启动子中 CpG 数量增加，雌雄甲基化差异减小。
Figure2.Global patterns of female X hypomethylation in the tree shrew PFC and its association with CpG counts.
3. 树鼩雌雄个体间基因表达差异与 DNA 甲基化的关系
在 32,302 个常染色体基因（包括蛋白编码和非编码 RNA 基因）中，有 479 个基因在雌雄间显著差异表达，而在 783 个 X 连锁基因中，有 14 个基因显著差异表达。常染色体上雄性偏向基因略多，X 染色体上雌性偏向基因较多。对 X 染色体上基因表达与 DNA 甲基化水平关系的分析发现，雌雄间 DNA 甲基化差异与基因表达差异无显著相关性，表明雌性 X 染色体低甲基化不导致性别特异性基因表达。
Figure3.Patterns of differential expression between males and females in relation to differential DNA methylation. Sex-specific expressed genes and their correlation with DNA methylation levels.
4. Xist的差异甲基化及其性别特异性表达
由于树鼩基因组数据库中未明确注释 Xist 基因，研究通过 BLASTN 搜索人类 Xist 基因序列确定其在树鼩基因组中的潜在位置，再利用 StringTie 的从头转录本组装功能识别新转录本，发现雌性样本产生的 Xist 基因转录本更长，且在雌性数据中表达水平极高，从而确定树鼩 Xist 基因位于 chrX: 54,721,977 - 54,759,147。其次，Xist 基因在雌雄树鼩 PFC 中表达差异显著，是性别差异表达最明显的基因之一。
在 Xist 基因区域（包括 37.2kb 基因body及上下游 30kb 区域），发现其 5' 端附近的 CpG 岛存在显著的雌性低甲基化现象，该区域内多个 CpG 位点的甲基化水平与 Xist 基因表达水平显著相关（13 个 CpG 位点，），且该区域的单个读段甲基化状态显示为等位基因特异性，推测来自失活 X 染色体的读段为低甲基化，表明树鼩 Xist 基因受 5' 端 CpG 岛的等位基因特异性甲基化调控，其调控方式在小鼠、人类和树鼩中保守，且通过分析公共 WGBS 数据可在其他物种中检测到类似模式。
Figure4.DNA methylation difference between females and males for the newly annotated tree shrew Xist gene.
四、总结
文章首次对树鼩前额叶皮层进行 DNA 甲基化研究，揭示了哺乳动物中 DNA 甲基化和基因表达的保守与差异模式；证实二者在基因组水平的关联，发现树鼩雌性 X 染色体普遍低甲基化但与表达增加无关，这是哺乳动物 X 染色体的保守特征；注释了 Xist 基因，表明其 5' CpG 岛的等位基因特异性低甲基化是关键调控特征，还注释了 Sry 基因并发现 Y 染色体连锁片段低甲基化；X 染色体连锁启动子的性别特异性甲基化在物种间存在差异，可能与基因组 CpG 含量的差异有关，这些发现加深了对树鼩 DNA 甲基化系统及哺乳动物 X 染色体调控进化的理解。
领克生物科技（昆明）有限公司致力于下一代高通量测序技术(NGS)、生物信息学分析、转化医学研究等领域的应用和推广。
服务项目包括单细胞多组学测序、基因组重测序、外显子测序、WGBS、转录组测序、LncRNA测序、miRNA测序等，优势项目包括单细胞多组学、Smart-seq2、ATAC-seq和CUT&Tag等前沿技术服务，并且能够进行各类组学数据的个性化分析服务等。
欢迎咨询了解~
电话：0871-65399960
邮箱：service@biolinker.com