Targeted activation of ferroptosis in colorectal cancer via LGR4 targeting overcomes acquired drug resistance
今天给大家分享由南开大学的陈佺教授发表在Nature Cancer上的一篇题为“Targeted activation of ferroptosis in colorectal cancer via LGR4 targeting overcomes acquired drug resistance”的文章。获得性耐药是癌症治疗的主要挑战，也是癌症死亡的主要原因。本研究建立了一个源自结直肠癌的类器官生物库，并通过重复低水平的化疗药物暴露来诱导获得性耐药；又设计了一种单克隆抗体（LGR4-mAb）与化疗药物联合使用时，靶向Wnt信号传导增强了铁死亡，显示了对抗难治性和复发性癌症的潜在机会。
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1 GR4–Wnt–β-catenin通路赋予PDOs耐药性
为了探索CRC耐药机制，建立了CRC PDOs生物库，包括来自40名患者的22个CRC PDOs，使用临床常用的结直肠癌化疗药物5-FU、顺铂、伊立替康（SN-38）以及FOLFOX和FOLFIRI联合施用，然后评估药物敏感性。结果显示，耐药（DR）组P1、P4、P5和P9 PDO对大多数化疗药物表现出更强的耐药性，而P7、P24、P30和P39 PDO对大多数化疗药物敏感。
为了探索耐药机制，通过RNA测序对所有PDOs进行转录组分析，并比较DR和药物敏感组之间的信使RNA图谱，基因本体（GO）分析显示，DR组中的几种肿瘤生存途径高度富集。此外，使用Reactome的基因集进行基因集富集（GSEA）分析，得到了相似的结果，表明Wnt通路在复发组和DR组中高度上调，值得注意的是，LGR4（Wnt-β-catenin通路上游的重要分子）被发现在所有DR PDOs中显著增加。通过qRT-PCR证实了Wnt通路中基因的mRNA水平的变化；LGR4阳性细胞响应5-FU或顺铂治疗，表现出显著的DR表型。以上表明，LGR4-Wnt信号通路有助于结直肠PDOs的耐药性。
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由于复发性或难治性CRC的获得性耐药在多轮化疗中不断演变，推断这种表型可以在培养的PDOs中重现。为了建立获得性耐药，首先将P1O、P7O、P24O和P30O的PDOs消化成单细胞，在基质胶中生长7天以形成单个PDOs，用低剂量的5-FU、顺铂或SN-38处理PDOs，随后剂量逐渐增加，直至达到IC50浓度的约五倍，经过这些化疗方案后，四个CRC PDOs获得了稳定的DR表型（DR P1O、DR P7O、DR P24O和DR P30O），与未经治疗的相比，IC50至少增加了四倍。根据活/死细胞染色显示，IC50浓度的药物在1周内杀死了超过50%的初始PDOs（P1O和P7O），而大多数DR PDOs在相同处理条件下仍然存活。转录组分析显示，与其亲本 PDOs相比，DR P1O中的Wnt信号通路显著上调。总的来说，LGR4和Wnt-β-catenin通路在DR PDOs中上调，导致获得性耐药。
作为一种细胞表面膜蛋白，LGR4与R-spondin相互作用，激活Wnt-β-catenin信号通路，从而获得DR PDOs表型和CSC性状。因此，假设限制配体R-spondin对LGR4的可及性可能会增加结肠癌化疗药物的敏感性并克服耐药性，产生了针对LGR4的单克隆抗体（LGR4-mAb），特异性靶向LGR4的胞外结构域，抑制LGR4和R-spondin之间的结合。
接下来，使用R-spondin处理CRC PDOs，以存在或不存在LGR4-mAb的情况下激活Wnt-β-catenin信号传导，与单独化疗药物治疗相比，添加LGR4-mAb在亲代PDOs和DR PDOs中均引起明显更多的细胞死亡；敲除LGR4使PDOs对LGR4-mAb与5-FU联合施用不敏感，尽管LGR4的敲除本身在5-FU治疗后降低了生存能力。综上所述，LGR4-mAb抑制Wnt -β-catenin通路使化疗诱导的细胞死亡变得敏感，从而克服CRC PDOs的获得性耐药。
4 LGR4抗体促进耐药PDOs铁死亡
接下来，解决LGR4-mAb与化疗药物共同治疗时促进细胞死亡的潜在分子机制。为了明确细胞死亡途径，使用了特异性靶向凋亡、坏死和铁死亡途径的抑制剂，结果表明，每种抑制剂都不同程度地抑制了单独化疗药物诱导的细胞死亡，在亲本PDOs和DR PDOs中使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1都表现出对LGR4-mAb致敏细胞死亡最显著的阻断作用。这些数据表明，铁死亡参与了LGR4-mAb和化疗联合治疗后的细胞死亡，特别是在DR PDOs中；免疫组织化学（IHC）染色显示，联合治疗后DR PDOs或亲代PDOs中4HNE水平较高，以及膜结合转铁蛋白受体，这是铁死亡的特征。此外，在LGR4-mAb和化疗药物的联合治疗下，铁下垂的分子标志物CHAC1和PTSG2的表达增加了五倍以上。这些结果表明，LGR4-mAb选择性地使CRC PDOs对铁死亡敏感，以克服获得性耐药。
5 Wnt -β-catenin-TCF7调控SLC7A11的转录
为了更好地了解铁死亡导致获得性耐药的分子机制，以及LGR4-mAb联合化疗药物如何促进铁死亡，综合分析了DR PDOs和亲本PDOs中铁死亡相关基因的mRNA谱，与铁死亡相关的几个基因确实在DR PDOs中上调。与亲本PDOs相比，DR PDOs中 SLC7A11的表达显著增加，这与LGR4的水平呈正相关。此外，在接受或未接受5-FU治疗的DR PDOs中，LGR4-mAb显著降低了SLC7A11的表达，表明LGR4-mAb抑制了SLC7A11的转录。
接下来，使用UCSC数据库的生物信息学分析预测Wnt-3a反应元件的TCF7结合基序，通过突变分析证实了其活性，染色质免疫沉淀（ChIP）和电泳迁移率变动分析（EMSAs）进一步揭示了TCF7直接与SLC7A11的启动子结合。因此，LGR4–Wnt–β-catenin通过TCF7转录因子的启动子结合来转录调节SLC7A11基因表达。
由于LGR4通过Wnt–β-catenin途径上调SLC7A11，进一步判断LGR4-mAb是否可以抑制SLC7A11的转录，使用R-spondin、LGR4-mAb或两者处理的细胞中进行了SLC7A11荧光素酶报告基因和芯片分析，R-spondin强烈激活SLC7A11报道基因并增加TCF占有率，但添加LGR4-mAb会减弱这种作用。接着，在PDOs中进行了挽救实验，LGR4敲低P1O中SLC7A11的异位表达将RSL3诱导的铁死亡恢复至与异位SLC7A11表达的P1O相似的水平，SLC7A11的异位表达很大程度上损害了LGR4-mAb增强RSL3诱导的铁死亡的作用。综上所述，LGR4依赖Wnt信号，通过转录上调SLC7A11，促进CRC PDOs对死亡的抗性。
接下来，将亲本 PDOs和DR PDOs分别皮下注射到裸鼠体内，当DR PDOs形成的肿瘤体积达到50 mm3时，通过腹腔注射不同化疗药物和LGR4-mAb对小鼠进行治疗。病理分析显示，在亲本或DR PDOs中，接受LGR4-mAb和化疗联合治疗的组具有最小的肿瘤尺寸和最高的存活率。与亲本PDOs形成的肿瘤相比，DR PDOs在小鼠体内形成了更大的肿瘤，这些肿瘤对单一化疗治疗具有难治性和耐药性，联合治疗显著抑制了异种移植肿瘤的生长，而单独使用LGR4-mAb则略微减少了DR PDOs的肿瘤形成。通过PDOs生物库的化学敏感性分析表明，LGR4单克隆抗体增强的细胞死亡水平与LGR4水平密切相关。
与上述结果一致，LGR4和SLC7A11的表达水平在大多数CRC PDOs中呈正相关（>80%），对化疗药物的敏感性与LGR4和SLC7A11的表达呈反比。值得注意的是，这些PDOs在使用LGR4-mAb治疗后对化疗药物的敏感性增加，而其他抗体如临床使用的西妥昔单抗（EGFR-mAb）和市售的LGR5-mAb则没有增加。几种LGR4和SLC7A11水平较高的PDOs，如P1和P4，对化疗药物更耐药，但可被LGR4-mab致敏。当考虑这两个基因时，LGR4和SLC7A11水平均较高的结直肠癌患者的总体生存率甚至比LGR4和SLC7A11水平较低的组更差。综上所述，LGR4-Wnt通路转录调节SLC7A11的表达，并且LGR4和SLC7A11的高水平表达可以预测结直肠癌患者的阴性临床结果。值得注意的是，LGR4-mAb在体内强烈抑制LGR4-Wnt通路，降低SLC7A11水平，促进铁死亡，提高化疗药物的效率。
本研究设计了一种单克隆抗体LGR4-mAb，能有效抑制LGR4-Wnt信号传导，并发现LGR4-mAb能显著敏化药物诱导的铁死亡；从机制上讲，LGR4依赖性Wnt信号转导转录上调铁死亡的关键抑制剂SLC7A11，从而获得获得性耐药。因此，针对结直肠癌耐药，通过LGR4-mAb靶向LGR4来选择性激活铁死亡是一种独特而强大的方法。
Zheng, Hao et al. “Targeted activation of ferroptosis in colorectal cancer via LGR4 targeting overcomes acquired drug resistance.” Nature cancer, 10.1038/s43018-023-00715-8. 30 Jan. 2024, doi:10.1038/s43018-023-00715-8
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