中国计量科学研究院，李亮、隋志伟、王晶、臧超、余笑波 qPCR 主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在以下问题：
校准品和样品间背景的不同将引入偏差，并且影响 PCR 的效率和测量响应；
低拷贝数的目标 DNA 分子不能通过扩增检测到；
样品的 PCR 扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；
DNA 提取时引入 DNA 溶液的杂质或者 DNA 降解影响了 PCR 动态扩增过程。
dPCR 是一项检测和定量核酸的新技术
它不同于传统的 qPCR，因为采用直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标，dPCR 通过计数单个分子从而实现绝对定量。dPCR 将传统 PCR 的指数数据转换成数字信号，仅仅通过显示程序设定的循环数后扩增是否发生， 即可克服上述困难，达到核酸的绝对定量。
dPCR 在进行扩增反应前，将含有 DNA 模板的 PCR 溶液稀释后分布到大量的独立反应室，单分子间通过稀释分离，并且独自进行 PCR 扩 增，最后分析每个扩增产物。这实现了通过先于 PCR 扩增的样品分离。这种样品的分配可以消除本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，简单计算出 DNA 的模板拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。
准确的定量依赖于 40～45 个循环的扩增，错误的阴性检 出水平(单 DNA 模板出现在反应室而未被检出) 非常低。数字 PCR 是一项具有可重复性的定量微量 DNA 分子的优良技术。其操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确 等优点使其成为了分子生物学研究中的重要工具。
Yung 等开发了一种关于非小细胞性肺癌患者血浆和肿瘤中的两种 EGFR 突变体( 第 19 外显子内缺失和第 21 外显子 L858R 突变) 的 dPCR 定量检测方法。第 19 外显子内缺失和第 21 外显子 L858R 突变占酪氨酸激酶突变响应的 85% 以上。实验结果表明这两种突变在预治疗的 35 个血浆样品分别检出 6 个(17%)和 9 个(26%)。与肿瘤细胞的测序结果相比，血浆EGFR 突变的灵敏度和特异性是 92% 和 100%。
上新 |高效多通道数字PCR ——国产数字PCR的引领者