2015 年 7 月 31 日，国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会发布了《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》，指出该指南旨在为临床分子检测实验室进行肿瘤个体化用药基因的检测提供指导。《指南》列出了 Sanger 测序法、焦磷酸测序法、NGS、扩增阻滞突变 系统（ARMS）-PCR 法、高分辨率溶解曲线法（HRM）、数字 PCR、荧光原位杂交、免疫组化（IHC）、荧光定量逆转录 PCR（Q-RT-PCR）等 9 种技术方法。
技术 路线 |
优点 |
缺点 |
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测序长度较长、易看新异位点、可看到少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失 |
灵敏度不高、突变等位基因需超20%才可检出。对肿瘤细胞要求高，含量需不低于50%，如低于50%，则假阴性概率高，不适合活检或细胞样本。 |
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检测灵敏度为 10%，相对Sanger 测序法高，对体细 胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异 |
测序长度较短，不能对长片段进行分析。检测灵敏度中等，难以检出低于 10%的突变。不适用于活检或细胞学样 本。 |
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高通量测序技术有三大优点是传统 Sanger 测序法所不具备的。第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个 点上同时阅读测序。第二，高通量测序技术有定量功能，样品中 DNA 被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。第三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27 亿美元，而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需 1 千美金。 |
检测灵敏度和测序深度相关，NGS 在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为 10%；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前 NGS 应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。 |
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检测灵敏度 1%，特异性高，重复性好；封闭体系，减少污染的可能性；扩增和检测同时进行，无需 PCR 后进行处理。 |
通过熔解曲线的图不能判断某一特异 性的变异体，下游分析中检测需要有 测序等补充。 |
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荧光定量 PCR 是检测拷贝数变化的一种快速且经济的技术方法，该方法技术可用于 RNA 表达水平检测该技术主要优点是检测快速、通量高、灵敏度好 |
主要不足是对肿瘤组织提取RNA 的质量要求较高，在检测基因表达量时判读标准尚未统一 |
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可多种荧光标记，显示DNA 片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；灵敏、特异性好，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型 |
FISH 检测对操作和判读技术要求较 高，诊断医师必须经过严格的 FISH 操作和结果判读培训，只有经 FISH 操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性；目前 FISH 检测的成本昂贵、通量低 |
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IHC 作为筛查工具优于FISH，具有经济快捷的优 点，尤其适用于大量样本的检测分析 |
影响 IHC 结果的因素主要包括抗体的选择、检测前组织的固定，观察者解释方面的差别等 |
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数 字 PCR |
灵敏度可达0.001~0.0001%，高特异性，可检测复杂背景下的靶 标序列；可高度耐受 PCR反应抑制剂；不必依赖对照品或标准品，可对目标拷贝数直接进行精确的鉴定，分析微小的浓度差异；实验数据分析便捷，每个微滴的检 测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化；可统计突变率，通过统计分析可得出靶点的突变率 |
数字 PCR 仪通量较低，目前通常能检测的信号为 FAM 和 HEX。一般单个反应 2 重反应效果最佳；数字 PCR 优点是灵敏度高，但是对于 DNA 浓度大的样本处理就没有优势，而且核酸浓度高时，每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊松分布；数字 PCR 虽然不依赖标准曲线，但是每次反应之间存在差异，短期内不能代qPCR，也不能代替其他金标准而作为首选方法。QX200等数字 PCR 仪目前仅用于科研用途，数字 PCR 走向临床检验还需要一段时间。（指南为 2015 年发布，为基于伯乐的 QX200 的判断，在通量、重复性已经过时。如小海龟 BioDigital·华芯片式数字 PCR，4 路荧光通道（FAM（SybrGreen）、HEX（VIC）、ROX、cy5），可定制增加一个荧光通道。而且数字 PCR 在检测重复性方面优qPCR 方面已经过越来越多临床验证） |
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