从人类诞生开始，我们就一直在与各种疾病作斗争，其中与癌症的斗争从未停止过。从最初了解肿瘤的临床表现到现在利用先进的光学成像技术看到肿瘤的真实结构，等等。先进制造和新的关键技术进入了显微镜领域，让科学家们“有了独特的见解”，解开了一个又一个未知的谜团。
01.
抗药性——癌症复发的元凶
虽然随着科学技术和医疗水平的不断发展，癌症的治愈率也在逐年提高，但仍有许多患者在接受治疗后出现复发。原来的药物治疗已经失去了对癌细胞的控制，导致癌细胞产生耐药性。因此，如何重新激活“耐药”癌细胞的死亡，成为科学家迫切需要解决的问题。
2019年，澳门科技大学中药品质研究国家重点实验室刘亮教授团队在Scientific Reports上发表文章:Neferine induces autophagy-dependent cell death in apoptosis-resistant cancers via ryanodine receptor and Ca2+-dependent mechanism，揭示Neferine通过Ryanodine受体(RyRs)的作用诱导“耐药”癌细胞死亡，并发现这一钙离子依赖途径的作用机制。
研究小组利用DeltaVision显微镜宽视场还原反卷积技术，将DMSO (Ctrl)、Neferine、钙螯合剂(BAPTA/AM、BM)或RyRs抑制剂(Ryr)添加到DLD-1 Bax Bak结肠癌细胞系(已知的多药耐药癌细胞系)中，对所有实验组和对照组进行成像，然后计数视场内细胞自噬标志物LC3 II颗粒的数量。结果表明，莲子碱能诱导DLD-1 Bax - Bak结肠癌细胞株自噬，添加BM和Ryr后这种现象消失，说明Neferine通过激活Ryr诱导抗凋亡癌细胞株自噬。
（左图，红色标记自噬标志物LC3 II；右图，统计不同条件下LC3 II颗粒占比）
在Hela细胞系中，课课组分别加入DMSO (Ctrl)、Neferine、AMPK inhibitor (CC)和CaMKK， β抑制剂(sto609)或钙螯合剂(BM)孵育4小时，荧光成像，并使用DeltaVision显微镜宽视场还原反卷积进行细胞计数。统计结果显示，当CC、sto609和BM加入到Neferine组时，LC3颗粒数量明显减少，表明CaMKK β- AMPK-mTOR信号级联在Neferine介导的细胞自噬中起重要作用。
（左图，统计不同条件下GFP-LC3颗粒占比；右图，绿色指示自噬标志物LC3颗粒）
作者利用显微镜(DeltaVision宽视场还原反褶积)等技术证明了荷花提取物荷花碱诱导耐药癌细胞自噬的作用，为该化合物未来用于耐药癌细胞的治疗提供了可能。
核糖体——癌细胞的“蛋白库”
02.
核糖体是由蛋白质和核酸组成的复杂生物结构，在活细胞中负责蛋白质的合成。在癌细胞恶性增殖需要大量蛋白质的情况下，核糖体数量增加，起着至关重要的作用。抑制核糖体的生物发生已成为近年来治疗癌症的一种新方法。
核仁是哺乳动物核糖体生物发生的早期阶段。核糖体的组装始于三个rRNA分子形成RNA前体。rRNA基因被较长的基因间隔物隔开，排列形成一个特定的染色体区域，核仁组织区。重复单元的转录活性和染色质状态取决于细胞的生理状态。在以往的研究中，科学家们利用电子显微镜成像揭示了核糖体核核体核核区生物发生的各个阶段，但活性rDNA染色质重复单元的空间位置和结构仍然没有很好地解决。
近日，Scientific Reports在线发表了德国慕尼黑大学Heinrich Leonhardt教授团队的成果：Super-resolution in situ analysis of active ribosomal DNA chromatin organization in the nucleolus。该研究利用DeltaVision OMX 3D-SIM超高分辨率技术揭示了核仁中活性rDNA染色质的结构，为癌症治疗的靶向位点提供了新的方向。
研究团队在IMR90（人胚肺成纤维细胞）和MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞中分别标记了UBF（Upstream Binding Transcription Factor，上游结合转录因子，编码活性rDNA）和NPM1（nucleophosmin，核基质蛋白）。3D-SIM成像下，图像从空间上揭示在MEF细胞中，具有转录功能的rRNA基因位于NPM1之中。
（蓝色指示DNA，红色指示UBF，绿色指示NPM1。3D-SIM结果显示强的UBF信号基本被限制在NPM1之中）
接下来，对转染GFP的MEF细胞进行UBF/ fibrarin /NPM1三通道成像。3D-SIM结果清楚地显示，在核核区，早期核糖体加工因子fibrarin几乎从UBF中分离出来。
（蓝色指示NPM1，红色指示UBF，绿色指示Fibrillarin。3D-SIM结果显示三种物质的空间位置关系）
利用FISH技术，在IMR90细胞中标记UBF和rDNA IGS（intergenic space，间隔区）进行3D-SIM成像，图像显示编码的rDNA区域和IGS完全分离。
（蓝色指示DNA，红色指示UBF，绿色指示rDNA IGS。3D-SIM结果显示UBF与rDNA IGS的空间位置关系）
超高分辨率成像技术的不断发展提高了我们对单细胞水平细胞过程的认识。弥补了电镜下核仁组织被破坏的缺陷，在保持组织活性的同时，揭示了活性rDNA染色质单元及其核仁内3D组织的关键特征。
03.
癌细胞转移——与细胞赛跑
肿瘤的各种治疗方法已经取得了相当大的进展，包括手术、放疗或化疗。尽管医学水平很高，但高侵袭性肿瘤具有高扩散、高浸润周围组织的特点，对现有的医学方法提出了巨大的挑战。它是一种生存率极低的恶性肿瘤。高通量筛选(High throughput screening, HTS)技术因其高效，已成为开发肿瘤特异性药物的公认方法。然而，到目前为止，仍然缺乏针对高迁移性癌细胞的HTS模型。
2020年6月9日，美国德克萨斯大学生物工程系Kim Young-Tae教授团队在Biocitation上发表了题为《迁移癌细胞的单细胞水平筛选方法及其在高通量mann中的潜在可行性》的论文。科学家团队利用IN Cell Analyzer高内涵成像分析技术，首次创造了一种新的测量方法:对高迁移癌细胞的高通量筛选方法，并分析了几种药物分子对癌细胞迁移速度的影响，证明了该方法的可行性。
当细胞在三维空间环境中迁移时，周围基质提供了由空间障碍引起的额外摩擦，周围环境的变化会影响细胞的形态和运动。现有的方法不能对细胞迁移过程提供物理约束。课题组以96孔板为基础，设计了符合每孔设置的微流控系统。整个系统由110个通道组成，通道尺寸为8 X 12 μ m，提供类似于人体组织分布的物理限制。
（A. 装有微流控系统的96孔板，底部红色窗口为放大图像，红色箭头指示微流控系统和2D控制区域；B. 每个微流控系统长6mm，包含110个独立的通道，两侧通道距边缘各910 μm；C. 将微流控系统通道面朝下装载在96孔板上，红色窗口为放大图像，系统厚度2.5±0.5mm，通道宽8 μm，高12 μm，每两个通道间隔30 μm，橙色部分表示控制细胞生长区域，灰色部分表示细胞迁移区域。）
为了记录单个细胞的迁移速率，课题组将人脑胶质母细胞瘤细胞系G55置于96孔板中培养，用Hoechst标记细胞核，借助In细胞分析仪的高内涵技术选择单个细胞，实时观察其迁移过程。
随后，研究小组在高通量药物筛选中尝试了该方法，量化了不同药物的迁移抑制作用，并探讨了不同剂量的Cytochalasin D (Relaxin D, CytoD)对细胞MStotal(总迁移率)和MSnet(净迁移率)的影响。
（在不同剂量，0.095μm、0.3 μm、0.95 μm和3 μm CytoD以及DMSO条件下孵育，追踪细胞的净迁移速度MSnet和总迁移速度MStotal）
综上所述，笔者创建了一种筛选高迁移癌细胞的HTS方法，最大限度地模拟了人体组织、血管等物理局限性，进一步了解了不同药物对癌细胞的作用。这为高通量筛选方法促进抗高侵袭性肿瘤药物的开发提供了巨大的潜力。
肿瘤微环境——肿瘤细胞的温床
04.
肿瘤细胞作为人体内区别于正常细胞的物质，一方面要努力避免免疫系统的攻击，另一方面也要寻找适合自身生长的地方。肿瘤微环境就像“城市的大门”，既为肿瘤细胞提供生长环境，又能抵抗“外来入侵”，导致肿瘤细胞肆意生长。
肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)的组成非常复杂，包括大量的免疫细胞、成纤维细胞、各种细胞因子、趋化因子和微血管。这些物质共同构成肿瘤微环境中强大的免疫网络，决定肿瘤的生长、发展和死亡。深入了解肿瘤微环境的异质性、细胞间的相互作用、空间定位等已成为近年来研究的热点之一。
近日，《自然通讯》在网上发表了美国匹兹堡大学S. Chakra Chennubhotla教授的一篇文章:《空间域分析预测彩色癌症复发风险及相关涡轮微环境网络的输入》。本文采用Cell DIVE多标签组织成像技术对直肠癌(CRC)组织切片中标记的55种生物标志物进行了成像和分析。建立整个TME信号网络的空间关系，预测和分析肿瘤复发。
研究小组将432例未接受化疗的直肠癌患者的肿瘤组织样本纳入Cell DIVE多重荧光标记法。每轮标记2-3个生物标志物(以DAPI标记的细胞核作为内参)。每轮染色成像漂白后，可在单个样品上标记55种生物标志物，包括上皮细胞、免疫细胞和一些参与细胞间粘附的细胞。翻译转录相关蛋白等。最大限度地标记更多的生物标志物，从空间获取更多信息，深入分析肿瘤样本。
（a-b. Cell DIVE多标成像技术成像示意图；c-e. 按照不同生物标志物将组织微阵列分割为三个空间区域；f. SpAn空间模型）
为了更好地从样本中提取信息，课题组开发了实体瘤空间分析和系统病理平台(SpAn)，分析整个TME信号网络的空间关系。从分割区域的空间分析，到患者的诊断，再到特异复发的空间结构预测，最后提出具有潜在价值的治疗方法。基于对432例直肠癌患者样本的分析，实验结果表明，对于不同类型的患者(如微卫星安装vs微卫星稳定，免疫治疗可以治疗MSS直肠癌患者，但对MSI直肠癌患者无显著影响)，SpAn可以识别不同患者样本中差异表达的空间网络。此外，SpAn方法用于预测直肠癌5年内复发风险，明显优于目前的常规技术。
（a-c. 不同生物标志物标记组织样本成像示意图；d. 划分不同区域进行空间分析；e. 患者诊断和预后症状；f. 推测不同区域特定复发的空间位置；g. 提供具有潜在性的治疗方法 ）
综上所述，使用SpAn结合Cell DIVE多标签组织成像技术，不仅可以实现在组织样本上标记尽可能多的生物标志物，还可以获得更多的空间信息;也可以通过算法构建模型来预测癌症复发风险，为精准治疗提供潜在的应用方向。
结语
癌症研究的途径漫长而受阻。科学家需要越来越多的有利的研究工具。当你看到这个，你一定会问，这些超级牛细胞成像技术的神圣之处是什么?别担心，让我们揭开他们神秘的面纱，向你展示真相。
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