【实验技能】CCK-8实验最全面的操作步骤

CCK-8是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的细胞生物学实验。CCK-8溶液可直接加入到细胞样品中，无需预先制备各种组分。细胞增殖越多，生长速度越快，细胞颜色越深，说明毒性较低;细胞毒性越大，颜色越浅。对于相同的细胞，颜色深度(生成的甲醛量)与细胞数量之间存在线性关系。

实验材料及试剂

细胞、96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微移液管、酶联免疫吸附仪、CCK-8检测试剂盒等。

1. 从生长良好的细胞中制备一定浓度的细胞悬液，每孔添加100ul到96孔细胞培养板中。通常每孔加2个细胞进行细胞增殖实验× 10³cells /100ul，每孔加5个细胞进行细胞毒性实验× 10³cells /100ul(每孔细胞的具体数量取决于细胞大小和增殖率等因素)。若为贴壁细胞，需在37℃预培养2-6小时后再进行实验。如果是悬浮细胞，不需要预培养。

2. 根据实验要求，在培养孔中加入0-10ul的待测样品，继续培养一段适当的时间。如果进行细胞毒性试验，则需要探索添加有毒物质后的培养时间。要确定有毒物质的性质和细胞的敏感性，一般是根据细胞周期，这至少需要1-2代的时间。

3. 取10ul CCK-8溶液，加入96孔细胞培养板。37℃孵育0.5-4小时。

4. 测量吸光度。建议采用双波长检测，检测波长430-490nm，参考波长600-650nm，或采用450nm单波长检测。

计算公式:细胞存活率=[(As Ab)/(Ac Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac As)/(Ac Ab)] × 100%

a:实验孔(包括细胞、培养基、CCK-8溶液、药物溶液)吸光度;

Ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物);

Ab:空白孔吸光度(包括培养基和CCK-8溶液，不包括细胞和药物)

1、若细胞初始培养量为200ul，则需加入CCK-8溶液20ul，依此类推。

2. 建议每个药物浓度孔设置3个复配孔，最后取平均值作曲线。

3. 设计实验控制，尽可能消除其他因素的干扰;

1)空白对照:加入等量细胞培养基、CCK-8溶液、药物但不加入细胞的孔可以使用;

2)阴性对照:不含药物但添加药物溶剂的细胞孔。

4. 试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应。如果待测物质具有氧化性或还原性，则可能干扰检测。在加入CCK-8溶液之前，有必要尝试将其去除(更换新鲜培养基)，以消除药物作用。如果药物作用比较小，可以省略培养基，直接从培养基中扣除加入药物后的空白吸收)。

5. 加入CCK-8溶液后，注意孵育时间。孵育时间的长短取决于细胞的类型和密度，以及其他实验条件。第一次实验可在0.5、1、2、4小时后用酶联免疫吸附试验(ELISA)读卡器检测，然后选择合适吸光度范围的时间点进行后续实验。

6、细胞在培养箱中培养时，培养板最外层的孔容易干燥挥发，体积不准确，增加误差。一般来说，最外层的孔只填充培养基，而不用作测量孔。

7. 若暂时不测定OD值，可在每孔中加入10% SDS溶液10 μ l终止反应，盖好培养皿，室温下避光保存。24小时内测量，吸光度不会有太大变化。一般建议立即进行测试。

8、在使用酶联免疫吸附试验(ELISA)读取器进行检测之前，必须确保每孔中没有气泡，否则可能会干扰测量。

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