PCR程序优化及引物设计

①模板DNA的变性

加热至93℃左右，使模板DNA双链或扩增后的双链DNA解离，形成单链，以便它与引物结合

②模板DNA与引物的退火(复性)

温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

③引物的延伸

72℃左右,DNA聚合酶以特定引物为延伸起点合成互补序列。

重复循环变性--退火--延伸三个过程就可就能将待扩目的基因，扩增放大几百万倍。

   注意   

  循环次数是否越多越好?  

一般在30个循环左右，然后循环数的进一步增加，并不意味着产物的数量一定增加。这是由于PCR扩增过程后期有些不利因素，如：

a. 底物和引物浓度降低。

b. dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低。

c. 非特异性产物或引物的二聚体会产生非特异性竞争。

d. 高浓度扩增产物变性不彻底。