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目前，世界范围内有5个亚群的轮状病毒（A群、B群、C群、E群和H群）在猪群中发现，其中A群轮状病毒是最常见的，研究相对充分。我国猪群的轮状病毒近几年备受关注，尤其是哺乳和断奶仔猪阶段导致的腹泻问题层出不穷，但主要集中在A群轮状病毒，其它公开数据并不多。猪群中轮状病毒的流行病学调查，展示了不同阶段猪群的感染情况与流行规律，也许可以起到一定借鉴作用。
I摘要 |
轮状病毒分为10个亚群（A至J），其中A群轮状病毒是人类和猪腹泻的主要原因。除A群轮状病毒外，关于人类和猪感染其他群轮状病毒的流行病学研究较少。目前，已经在猪中鉴定出五种亚群的轮状病毒（A，B，C，E 和H）。在本研究中，我们调查了不同日龄，不同季节和不同混合感染的腹泻的猪群中的A群，B群，C群和H群轮状病毒的感染率。建立了两种分子检测方法来区分A群，B群，C群和H群轮状病毒，对从患有急性肠炎的哺乳仔猪，断奶猪和育肥猪中收集的962份粪便标本进行了检测。总体而言，样本中检测到高比例的轮状病毒（78%），其中A群轮状病毒占比最高（53%），其次是C群（45%），B群（43%）和 H群（14%）。A群轮状病毒在哺乳仔猪（58%）和断奶猪（64%）中更常见，而B群，C群和H群轮状病毒经常在育肥猪中检测到。只有A群和B群轮状病毒感染有季节性感染的特点，并在不同日龄的猪只中存在差异。轮状病毒经常与其他病原体出现混合感染。该研究描述了猪群中各种轮状病毒亚群的多样性，确定了调查地区不同种类的轮状病毒感染的季节性和日龄特点。
I 1.简介 |
轮状病毒是呼肠孤病毒科的成员，是无包膜病毒，直径约70nm的三层衣壳包围了11个独立片段的双股正链RNA，在显微镜下观察它们通常表现为轮状颗粒。自20世纪70年代初发现以来，人们注意到，基于VP6介导的抗原反应性和凝胶电泳中11个基因组片段的迁移模式，存在不同的轮状病毒组。基于VP6基因序列，以及后来的全基因组测序，现在已经识别出10种不同的轮状病毒亚群或者种（A到J），它们在人类和动物宿主中分布不同。其中，已知A群、C群、E群、H群、I群和J群轮状病毒可感染哺乳动物，而A群轮状病毒是大多数哺乳动物宿主中的最常见亚群。A群轮状病毒是人类主要的肠道病原体，目前全球都在使用疫苗来预防儿童急性胃肠炎。已经报道了几个轮状病毒由动物传人的例子。2013年后，全球出现了一种马源性A群轮状病毒流行株，提醒人们轮状病毒具有人畜共患的可能性。
轮状病毒在世界各地的仔猪中也有检出。在猪场中，轮状病毒相关的肠道疾病是猪群发病和死亡的主要原因之一，导致相关的经济损失。目前，有五个亚群（A群，B群，C群，E群和H群）已在受腹泻影响的不同日龄的猪的粪便中鉴定出。A群轮状病毒是最常见的，在流行病学，遗传变异性和致病性方面都已被充分研究。A群轮状病毒主要感染哺乳仔猪，但最近的研究也表示断奶仔猪有很高的发病率，但与腹泻发病相关与否不确定。在全世界爆发腹泻的猪群中，哺乳仔猪，断奶猪和断奶后的猪群中都检测到C群轮状病毒。在南美和北美（33%）以及日本（25.9%）有肠道表现的猪中发现了B群轮状病毒感染。欧洲国家关于B群轮状病毒的流行病学数据很少。捷克共和国（0.6%），德国（1.6%）和西班牙（9.3%）的肠炎猪的B群轮状病毒感染率较低，而大日龄猪的感染率更高。B群轮状病毒是一个高度可变的群体，猪上已发现9种不同的VP6基因型。三十年前在英国的一个猪群中报道了E群轮状病毒，但在首次鉴定后，再未在其他地方报道过。此外，尚无有关E群轮状病毒的序列数据，这一曾经有过报道的轮状病毒仍有待确认。日本，美国（15%）和巴西（18%）的大日龄猪偶尔会出现H群轮状病毒感染。欧洲没有关于H群轮状病毒流行病学的数据。
尽管肠道疾病常与寒冷季节相关，但猪群轮状病毒感染没有表现出季节性，但有空间上、时间上的相关性，研究表明它们可能依赖于其他因素。此外，混合感染的存在使轮状病毒的流行病学变得复杂，其它肠道病原体可能会增加疾病的严重程度。特别是，在几项研究中已经描述了轮状病毒与流行性腹泻病毒，艰难梭菌，产气荚膜梭菌和大肠杆菌的混合感染。
总体而言，猪的轮状病毒流行病学信息不完整，非A群轮状病毒的相关信息相对缺失，这是因为现有的诊断工具主要针对A群轮状病毒的。为了研究不同种类的猪轮状病毒的流行病学模式，我们建立了两种基于逆转录（RT）聚合酶链反应（PCR）的定量多重检测方法，用于同时检测A群、B群、C群和H群轮状病毒。然后，我们用这个定量RT-PCR方法分析了意大利北部地区被动监测期收集到的腹泻偶发和暴发猪只的粪便或肠道内容物。
| I 2.结果 |
2.1轮状病毒多重RT-qPCR检测方法的建立
设计、优化了A群，B群，C群和H群轮状病毒单独测定，并将其组合成两种多重RT-qPCR：A群-B群轮状病毒和C群-H群轮状病毒。在我们的研究中设计的寡核苷酸的电子计算机分析，对NCBI GenBank中的轮状病毒VP6序列进行，显示与A群轮状病毒I5基因型完全匹配；B群轮状病毒 I11、I12和I13基因型；C群轮状病毒I1、I4、I5、I6、I7、I10、I11和I13基因型和H群轮状病毒I1基因型。通过构建A群、B群、C群和H群轮状病毒的四条单独标准曲线来评估分析的效率。回归分析表明，它们的效率非常匹配（R2>0.99），均高于95%（表1）。使用阳性对照样品的临界稀释液测试的灵敏度显示，显示所有目标的检测下限相当于每个反应102个拷贝。根据计算出的检测下限，将Cq截止值设置为37。这两种测定的特异性均通过RT-qPCR对15个不同于轮状病毒的猪肠道病原体分离物进行扩增而得到证实。为了评估提取中是否存在污染物，以及RT-qPCR测定的可靠性，在每次运行中分析了阴性对照，无模板对照（NTC），内标（IC）和阳性对照。两种多重测定均成功扩增了阳性和内部对照，而空白对照和阴性对照均未观察到扩增曲线。
表1.A群-B群轮状病毒和C群-H群轮状病毒多重RT-qPCR测定的性能参数
2.2不同亚群轮状病毒在不同日龄段猪之间的分布
在2016年11月至2019年12月期间，78%（750/962）的样本呈轮状病毒阳性。A群轮状病毒检出率为56.8%，B群轮状病毒检出率为43%，C群轮状病毒检出率为45.3%，H群轮状病毒检出率为14.1%。且大多数为轮状病毒混合感染状态（60.7%，455/750）。在单一群轮状病毒感染（39.3%，295/750）中，A群轮状病毒最多（17.2%），其次是C群（6.9%），B群（5.7%）和H群轮状病毒（0.9%）。为了按日龄段评估轮状病毒的分布，将样本分为哺乳仔猪、断奶猪和育肥猪（图1）。在哺乳仔猪中，A群轮状病毒最常见（57.9%，184/318），主要为单一感染（34.3%）。在断奶猪中，A群和C群轮状病毒更为普遍（分别为64.4%和60.3%），经常与其它群轮状病毒混合感染。混合感染占A群轮状病毒阳性样本的53.1%和C群轮状病毒阳性样本的52.7%。A群，B群和C群轮状病毒在育肥猪中分布均匀（分别为51.4%，52.3%和55.1%），并且主要在混合感染中检测到。H群轮状病毒随着日龄的增长而增加，从哺乳仔猪的3.1%到育肥猪的22%不等。有趣的是，大多数H群轮状病毒感染（93.4%，127/136）与其它群轮状病毒混感。如表2所示，轮状病毒分布似乎受日龄段的影响。断奶猪轮状病毒感染率（84.5%）显著高于哺乳仔猪（72%，P=0.0005）。A群轮状病毒在断奶猪中占主导地位（64.4%），与育肥猪相比差异显著（51.4%，P=0.0012）。此外，育肥猪和断奶猪的B群和H群轮状病毒感染率高于哺乳仔猪（P<0.0001）。断奶猪（60.3%）和育肥猪（55.1%）中的C群轮状病毒较哺乳仔猪（21.7%，P<0.0001）更常见。考虑到轮状病毒以单一或混合感染的状态存在，哺乳仔猪中A群轮状病毒的感染率显著高于其它阶段猪群（P<0.0001）。相比之下，断奶和育肥猪中B群、C群和H群轮状病毒混合感染的数量高于哺乳仔猪（P<0.0001）。
图1.不同日龄段轮状病毒流行情况
2.3轮状病毒在不同日龄段的季节分布
由于研究期间（2016-2019）每个月的分析样本数量较少，因此按季节汇总。在哺乳仔猪，轮状病毒感染的高峰期出现在春季，而夏季最低（图2）。在轮状病毒群中，A群轮状病毒表现出最明显的季节性，春季是RVA流行高峰期。尽管在哺乳仔猪，轮状病毒感染率与肠炎数趋势一致，但在断奶和育肥猪，轮状病毒感染率与肠炎数不成比例（图2）。值得注意的是，在断奶仔猪中，只有B群轮状病毒表现出季节性分布，春季和秋季是感染高峰。育肥猪的轮状病毒感染率从春季到秋季是恒定的。考虑到轮状病毒群的分布，与研究期间的剩余部分相比，冬季A群和B群轮状病毒的发病率较低。总之，我们的数据显示，所有日龄段的A群和B群轮状病毒都有明显的季节性波动，而C群和H群轮状病毒在整个研究期间更加分散。
图2.哺乳仔猪、断奶猪和育肥猪RV的季节性特征
2.4轮状病毒与其它病原的混合感染
表2.哺乳仔猪(S)、断奶猪(W)和育肥猪(F)RV分布
根据不同日龄段，调查了轮状病毒与不同的病毒和细菌的肠道病原的混合感染情况。分别对110头和41头哺乳仔猪和断奶仔猪进行了大肠杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和流行性腹泻病毒分析，对163头育肥猪进行了大肠杆菌、流行性腹泻病毒和导致大日龄猪胃肠炎的致病菌（猪痢疾短螺旋体、厌氧螺旋体和胞内劳氏菌）分析。表3总结了每个日龄段轮状病毒混合感染和单一感染的情况。简而言之，在5.5%（6/110）的哺乳仔猪，14.6%（6/41）的断奶猪和1.4%（2/163）的育肥猪中检测到轮状病毒的单一感染。相反，在哺乳仔猪68.2%（75/110），断奶猪63.4%（26/41）和育肥猪85.3%（139/163）中观察到轮状病毒的混合感染。对于所有日龄段猪只，大肠杆菌是与轮状病毒感染最相关的病原体，但并非所有大肠杆菌菌株都具有致病性。在60%（66/110）的哺乳仔猪，41.5%（17/41）的断奶猪和81%（132/163）的育肥猪中检测到它的存在。
表3.哺乳仔猪、断奶猪和育肥猪中肠道病原体的流行情况
I 3.讨论 |
轮状病毒在患有消化道疾病的猪群中高度流行，并与死亡率增加、生长迟缓和经济损失有关。根据欧洲国家轮状病毒感染分布的数据来看，主要的B群，C群和H群轮状病毒很少或根本没有。
收集流行病学数据的一个主要限制是可靠诊断工具的可用性。虽然有几种直接诊断方法可用于检测A群轮状病毒抗原和RNA，但这不适用于非A群轮状病毒亚群。一般来说，我们在78%的受肠炎影响的猪中发现了轮状病毒感染，断奶猪的病例数最多（85%）。事实上，在断奶阶段，仔猪更容易受到感染，因为其免疫系统容易受到应激因素（换料，断奶和环境变化）影响。尽管A群轮状病毒感染在断奶猪中更为常见，但A群轮状病毒单一感染主要在哺乳仔猪中检测到（34%），这表明A群轮状病毒感染在这个日龄段中起主要作用。
有趣的是，在我们的调查中，观察到受肠炎影响的猪的A群轮状病毒和B群轮状病毒感染率的季节性影响，根据日龄段的不同，存在一些差异。值得注意的是，哺乳仔猪的A群轮状病毒在春季达到峰值，育肥猪的A群轮状病毒在春季和秋季达到两个峰值。同样，在断奶猪群中，B群轮状病毒在春季和秋季达到峰值，而在育肥猪中，B群轮状病毒在春季和秋季之间稳步增加。相比之下，C群轮状病毒和H群轮状病毒似乎没有受到季节变化的影响。有趣的是，在仔猪中，轮状病毒感染率与肠炎数量之间存在相关性，表明肠炎数量与轮状病毒感染率之间存在关联。相反，在断奶和育肥猪中，轮状病毒感染率与我们诊断实验室报告的肠炎数量不匹配，表明轮状病毒在大日龄猪的肠炎病因中起次要作用。先前研究发现A群和C群轮状病毒的感染曲线并没有出现任何季节性峰值。同样，2009年至2011年进行的一项多层次模型研究考虑了地理位置和日龄等影响因素，报告了A群轮状病毒和B群轮状病毒感染的波动。可能其它因素，如混合感染的存在，在不同季节和不同日龄段猪只中表现出与轮状病毒不一样的易感性。
由于腹泻可能是由多种肠道病原体引起或加剧的，因此我们还关注了混合感染的频率。先前的研究报道，低日龄仔猪的肠炎通常与单一病原体有关。相比之下，在本研究中，我们报道了低日龄猪只混合感染的比例较高（89%的乳猪和77.5%的断奶猪）。在混合感染中，轮状病毒的比例很高，育肥猪为85%，哺乳仔猪和断奶猪分别是68%和63%。这些数据表明，特别是在大日龄猪中，肠道疾病可能是病原体混合感染的结果。总的来说，大肠杆菌是在所有日龄段猪只中与轮状病毒最相关的病原体，然而大肠杆菌的致病性仅在少数样本中检测到，阻碍了对其在感染中作用的判断。轮状病毒可能在断奶猪肠炎的病因起主要作用，断奶猪的轮状病毒单一感染的比例较高（断奶猪14.6%，哺乳仔猪为5.5%，肥育猪为1.2%）。
总之，本研究报告了意大利受肠道疾病影响的猪群中不同亚群轮状病毒的高感染率。观察到不同日龄段猪只、不同亚群轮状病毒群之间的感染率存在差异，已经A群和B群轮状病毒有季节性感染的特点。B群，C群和H群轮状病毒的高检出率表明，非A群轮状病毒也可能在猪腹泻的病因中起重要作用。对非A群轮状病毒导致的腹泻进行诊断有助于更好的理解它们的危害，并最终制定行之有效的控制策略。
I 4.材料与方法（略） |
原文链接：https://doi.org/10.3390/pathogens11040467
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编辑：王 岩
责编：孟相秋
审核：王红岩
