非洲猪瘟七基因缺失苗的研究报告解读

3月1日，哈兽研科研团队在《中国科学：生命科学》英文版杂志发表一篇研究论文，报道了一株人工缺失七个基因的非洲猪瘟弱毒疫苗对家猪具有良好的安全性和有效性，以及具备大规模生产的条件。消息一出，业界震动，连相关的股票都有异动。各路媒体争相报道，但是还是有很多人不明白其中原委，看完报道依然是云里雾里。笔者觉得有责任有义务将这个文章好好梳理一下，看看这个最新的文章究竟做了哪些研究工作，又有哪些重要结论？

首先，要明确一个概念，什么是七基因缺失？其实这是一个对之前双基因缺失的一个科学说法的修正。2019年8月哈兽研申请了一项专利《基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用》，在此项专利里面描述通过基因工程的方法构建了MGF360-505R缺失（后被称为单基因缺失）和MGF360-505R和CD2v联合缺失（后被称为双基因缺失）两种基因缺失疫苗，并公布了一些初步的实验结果。而这里所说的MGF实际上严格的说不是指一个单独的基因，而是一个多基因家族，而MGF360和MGF505R又是其中两个小的基因家族。哈兽研在这两个家族上各缺失了三个基因，分别是MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R（见图1）。所以在这篇文章中将MGF360-505R（单基因缺失）改称为HLJ/18-6GD（6基因缺失），将MGF360-505R和CD2v联合缺失（双基因缺失）改称为HLJ/18-7GD（7基因缺失）。很显然，现在的表述更科学也更合理，但是他挑战了整个行业的接受能力，绝大部分的行业人士都一下子懵了，还以为又搞出个新东西呢，而实际上只是一个称呼的改变而已。

图1: 非洲猪瘟基因缺失疫苗毒株的基因结构图

那么，这个文章其实是在之前的研究基础上补充了很多实验数据，尤其是使用商品猪的实验室研究数据。我们接下来就给大家详细的分析一下这篇文章究竟做了哪些研究？

  图3 三种候选疫苗的免疫保护强毒攻击实验

表2 三种候选疫苗免疫组强度攻击后的体温变化

除了观察攻毒后动物死亡和体温反应以外，研究者还研究了不同疫苗免疫后再攻毒，强毒在各个脏器的带毒情况。结果显示（图4），HLJ/18-7GD的两个免疫剂量组攻毒后各脏器在各个脏器的带毒浓度最低。HLJ/18-9GL&UK-Del组的实验动物在攻毒后各脏器含高浓度的野毒核酸。HLJ/18-6GD组也有个别动物在脏器内核酸浓度较高。综合脏器带毒和体温反应的实验结果，HLJ/18-7GD候选疫苗对于强毒攻击的保护效果最好，要略强于HLJ/18-6GD组。

HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD在猪群传代安全实验

为了研究疫苗在动物体内传代后是否返强的问题，研究者设计了实验，将超高剂量107TCID50（是前面做免疫保护实验的高剂量组免疫剂量的100倍）的HLJ/18-6GD 和HLJ/18-7GD分别接种SPF动物进行传代研究。

HLJ/18-6GD疫苗接种后第一代动物，发现在血液和脾脏中有带毒，其他脏器不带毒。将第一代动物血液内的病毒继续接种第二代动物，就发现第二代动物的血液、心脏、肝脏、肺脏、淋巴结等带毒。发现该疫苗在猪体内适应性很好，繁殖迅速。继续传到第5代，发现有一头猪出现严重发病并死亡。将这头死亡猪病料接种第6代SPF猪5头，结果其中4头表现出明显发热，其中1头发病严重并在接种后第13天死亡。说明HLJ/18-6GD在猪群中有返强的风险。所以，HLJ/18-6GD将不能作为商品化疫苗的候选毒株了。

HLJ/18-7GD疫苗接种后第一代动物后，血液及各脏器均检测不到病毒，研究者就将血液收集盲传了5代，结果均未检测到病毒，实验动物也健康。后来研究者提高接种剂量至107.7TCID50，再次做传代接种SPF猪的安全性试验。结果发现，第一代动物在接种后第5天部分淋巴结检测到病毒，而血液和其他脏器均没有检测到。将淋巴结再次接种第二代的4头猪，并分别在接种后第8天和第10天各剖杀2头，结果在第10天剖杀的2头猪的淋巴结又检测到了病毒。再将此淋巴结病料接种第三代动物，就没有检测到病毒了。根据试验结果，超高剂量的HLJ/18-7GD疫苗接种后只有短暂的在淋巴结出现，而且传3代以后就检测不到，所以，该疫苗不大可能在猪群中复制返强。

HLJ/18-7GD疫苗对于商品化仔猪保护性和怀孕母猪的安全性研究

综合上面所有的实验，即安全又具有保护力的候选疫苗毒株就只剩下HLJ/18-7GD一种了。之前的实验都是用SPF猪做的，那么既然筛选出一个优秀的候选毒株，接下来研究者要用从市面上购买的商品仔猪做免疫保护实验和农场的怀孕母猪做疫苗免疫安全性试验。

首先我们看一下仔猪的免疫保护攻毒实验，在市面购买49日龄的商品化仔猪，进行分组，分为单次免疫&肌肉接种攻毒组，2次免疫&肌肉接种攻毒组，2次免疫&口服接种攻毒组。免疫剂量均为10⁵TCID₅₀，2次免疫的时间都是间隔3周，然后用强毒攻毒。几组实验的结果分别如下：

这个实验是50日龄免疫1次，78日龄攻毒，在99日龄全部剖杀，免疫组5头对照组5头。结果显示（图5），攻毒后11天内对照组全部死亡，而实验组全部存活。而且脏器的核酸检测显示实验组只有一头猪攻毒后在血液、扁桃体和淋巴结检测到病毒，其他4头猪从始至终均没有检测到病毒。相比之下，对照组动物全部脏器均检测到高浓度病毒。说明保护效果非常好。

这个实验是50日龄和71日龄免疫两次，85日龄攻毒，在106日龄全部剖杀，免疫组5头，对照组4头。结果显示（图6），攻毒后11天内对照组全部死亡，而实验组全部存活。而且脏器的核酸检测显示实验组只有一头猪攻毒后在淋巴结检测到非常低浓度的病毒核酸。其他4头从始至终均没有检测到病毒。相比之下，对照组动物全部脏器均检测到高浓度病毒。说明两次免疫的效果也非常好，并且优于单次免疫。

这个实验设计和上面两次免疫的实验设计一样，只是攻毒方式不同，上面的肌肉注射，这个实验是口服接种强毒。口服接种更接近于临床感染，更具有说明意义。这个实验结果显示（图7），所有实验组动物免疫后全部存活，对照组全部死亡，攻毒后所有动物所有脏器均检测不到病毒，对照组所有动物各脏器检测到高浓度病毒核酸。说明两次免疫对于口服接种攻毒的保护效果非常好。

然而，为了研究疫苗的保护期。在另外一个实验中，研究者对于两次免疫的实验组，两次免疫后间隔了80天进行攻毒，结果保护率只有80%，免疫系统也不能有效清除病毒，实验组的猪各脏器均带毒。那么这样的结果显示免疫后的保护期不太理想。为了解决这个问题，研究者提高了免疫剂量，由10⁵TCID₅₀提高到10⁶TCID₅₀。实验结果如下图（图8）：

这次实验只在50日龄进行了1次免疫，在120日龄进行攻毒，间隔了70天。那么这次保护率达到了100%，脏器也基本不带毒（只有个别在淋巴结低浓度）。说明提高免疫的剂量至10⁶TCID₅₀可以改善该候选疫苗的免疫保护期。研究者推断如果用10⁶TCID₅₀剂量进行两次免疫的话，保护效果将肯定更好，保护期更长，但是没有做相关实验。

以上的几个实验，除了观察死亡和脏器病毒检测情况外，还记录了攻毒后的体温变化情况（表3）。单次免疫组，有1头猪发热，持续了2天，最高40.6度；两次免疫肌肉注射攻毒组也是有1头猪发热，持续了2天，最高41.2度；两次免疫口服攻毒组也有1头发热，持续了2天，最高41.8度。在做免疫保护期实验的实验组中，6头实验动物中2头在攻毒后出现了发热，持续2天，最高41.3度。当然，这些猪最终都是恢复并全部存活的。相对之下，各实验中的对照组的所有猪都出现发热并最终死亡。这个实验结果告诉我们该疫苗的免疫可以提供稳固的保护力，在接受致死剂量的强毒攻击后保护动物不死亡，但是有少部分猪会出现短暂的体温反应。

最后，我们再来看一下在怀孕母猪上的安全性试验，这也是所有人比较关心的实验结果。这个实验一共使用了8头第一胎的母猪，其中1头在怀孕35天（早期），3头在怀孕63天（中期），2头在94天（后期）分别接种HLJ/18-7GD疫苗。另外2头作为对照。然后观察这8头母猪的产子情况。结果如下：（表4）。

结果显示，这8头猪最终都正常分娩了，免疫组死胎木乃伊的数量均在正常范围内，免疫组和对照组没有差异。这个实验结果显示，HLJ/18-7GD疫苗的免疫不会对怀孕母猪造成繁殖性能的影响，安全性很好。

编       辑｜王  岩

责任编辑｜徐  敏

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