StarBright™ 43色光谱流式方案

流式细胞术可以通过对细胞表型的检测快速准确的区分出异质化样本中的各种细胞类型。随着检测指标的增加，还可以进一步探究各个细胞群体在特定疾病中发挥的功能以及细胞间的相互作用。尤其随着光谱流式技术的发展，允许方案中同时检测的指标数量大大增加，可以获取更多信息帮助研究各个细胞亚群在疾病发生发展中的作用机制，为疾病的治疗提供指导。

构建43色光谱流式方案

该方案包含了22种StarBright染料、14种传统染料、活性染料以及6种BD Horizon染料。

APC, allophycocyanin; A647, Alexa Fluor 647; BV, Brilliant Violet; BUV, Brilliant UltraViolet; Cy7, cyanine7; FITC, fluorescein isothiocyanate; PB, Pacific Blue; PE, phycoerythrin; SBB, StarBright Blue; SBR, StarBright Red; SBUV, StarBright UltraViolet; SBV, StarBright Violet; SBY, StarBright Yellow

方案中的43种染料的光谱特征在光谱流式仪器上通过运行单染对照管获取，用于后续的数据解析分析。

43种染料光谱获取于5-L Cytek Aurora System

样本处理及操作方法

人外周血使用裂红液（cat#BUF04B）处理后加入Fc封闭剂（BUF070B）和活性染料（cat#L23105,invitrogen）降低细胞表面Fc受体造成的非特异性信号，同时排除死细胞带来的干扰。孵育结束后对样本进行清洗和重悬后进行流式抗体的孵育，全染样本的染色缓冲液为Brilliant stain Buffer (BD Bioscience),单染对照管细胞的染色缓冲液为PBS+1%BSA，所有抗体的用量都做了滴定。

结果展示

该实验样本在5-L Cytek Aurora仪器上进行检测及数据的采集，通过SpectroFlo Software, version 3.2.0（Cytek  Biosciences）和三方分析软件FCS Express 7（De Novo Software）进行数据的分析。根据解析后的数据分析及设门，淋巴细胞、单核细胞、粒细胞以及他们谱系内特定的细胞亚群均被准确的鉴定出来。

1.淋巴细胞/单核细胞/粒细胞：通过FSC/SSC、CD45和活性染料的设门逻辑鉴定出主要的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体。
2.T细胞特定亚群分析：αβT淋巴细胞(CD3+TCRγδ-)进一步分化为辅助T细胞(CD3+TCRγδ-CD4+)和细胞毒T细胞(CD3+TCRγδ-CD8+)。对于CD4+T细胞和CD8+T细胞来说CD45RA和CD45RO的表达分析可以进一步确定naïve和memory不同分化时期的亚群，CD57的阳性表达用来确定效应T细胞亚群（CD4+CD57+,CD8+CD57+），CD45RA联合CCR7分析又可以将naïve T进一步分化形成的中央记忆T(CD45RA-CCR7+)细胞和效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)鉴定出来。检测CD62L,HLA-DP-DQ-DR, CD195, 和CD31也可以用来鉴定T细胞Naïve和Activated不同的分化状态。Treg调节性T细胞(CD4+CD25+CD127low)是辅助性T细胞的另外一个亚群，CD45RA-CD27+表达模式将Treg细胞的记忆型准确鉴定出来。PD-1和TIGIT的表达水平确定了样本是健康非疾病状态。γδT淋巴细胞(CD3+TCRγδ+)和MAIT细胞(CD3+TCRVa7.2+)通过特异性表达的TCRγδ、TCRVa7.2抗原设门分析。
3.NK及NKT细胞：CD3是否表达可以区分NKT(CD3+TCRγδ-TCRVa7.2-CD56+)和NK细胞，NK细胞在CD3-CD19-的设门模式下分析CD56, CD31, 和 CD161 的表达，CD56和CD16的表达水平可以区分早期、成熟和终末分化期的NK细胞亚群。
4.B淋巴细胞：CD3-CD19+分析出B淋巴细胞，CD20和CD27的不同表达水平可以进一步鉴定具有不用功能的特定亚群，如抗体分泌B细胞(CD20-CD27+)、记忆B细胞(CD20+CD27+)和初始B细胞(CD20+CD27-)。记忆B细胞是否经历类型转换可以根据IgD和CD10来确定。
5.单核细胞：外周血样本中通常检测三种类型的单核细胞，在CD45+HLA-DP-DQ-DR+细胞群中，分析CD14和CD16的抗原表达模式，区分出经典单核细胞(CD14+CD16-)、中间单核细胞(CD14+CD16+)和非经典单核细胞(CD14dimCD16+)。
6.DC细胞：外周血中树突状细胞作为专职的抗原提呈细胞目前没有特异性的分子标志物，主要通过形态学及组合性细胞标志物等进行鉴定。HLA-DR、CD123和CD11c在流式检测中可以找到外周血单核细胞中的经典树突状细胞(HLA-DR+CD11c+)和浆细胞样树突状细胞(HLA-DR+CD123+)两大主要亚群，进一步分析经典树突状细胞的CD16和CD1c的表达模式，可以找到样本中DC1和DC2的含量。
7.粒细胞：三种粒细胞亚群使用组合性标志物进行鉴定。CD45、CD123和 CD38阳性表达在嗜碱性粒细胞表面。细胞表面不表达CD3、CD14同时阳性表达CD16可以确定为中性粒细胞，这三个标志物同时阴性表达而CD10阳性表达可以鉴定出嗜酸性粒细胞。

主要淋巴亚群的降维分析

StarBright荧光染料介绍

StarBright系列染料是Bio-Rad公司开发的一款荧光纳米颗粒，可用于流式及WB实验，目前这个系列的染料已经上市33种。

33种StarBright染料设计了不同亮度，可以根据检测靶标的表达量进行灵活选择。多数StarBright染料与目前现有的相似染料相比具有更高的亮度。

StarBright系列染料设计了更窄的激发和发射光谱，最大程度避免了染料之间光谱干扰，使得传统流式中补偿的调节更加简单。

StarBright荧光染料稳定性高，相对于串联染料可以更好的耐受固定剂。在需要检测胞内核内抗原时，固定剂的使用不会导致染料的破坏，从而有效避免对相关通道造成的额外信号干燥。由此导致的spread error更低，有利于设门的准确性。

兼容性是多色流式一个非常重要参数，尤其是在光谱流式中，通常一个光谱多色方案中涉及多个品牌抗体的使用，如果流式抗体对于染色缓冲液有特殊的要求会增加方案设计或者实验操作的复杂性。StarBright系列标记的流式抗体在多种常见的染色缓冲液中进行测试，都可以兼容。

在对染色缓冲液具有较高兼容性的基础上，其独特的光谱特征可以很容易的加入到现有的光谱多色方案中，满足用户对多色方案调整的需求。

StarBright染料不会非特异的结合单核细胞群，避免假阳性信号对实验结果的干扰，从而降低实验验证的成本及购买封闭剂的成本。

StarBright系列染料标记的流式抗体在样本孵育时可以进行过夜孵育和抗体预混。根据实验条件的限制灵活的调整孵育方案，不会影响实验结果。尤其对于多色流式方案，抗体预混的稳定性可以有效降低实验操作的繁琐，避免多次添加抗体造成的误差，同时保证实验结果的可重复性。Bio-Rad内部测试了预混后不同时期（3个月/6个月/12个月）的检测结果，检测结果具有较高的一致性。

Bio-Rad这款专利的StarBright系列荧光染料，不断的优化现有染料存在的缺陷，并且种类齐全，使得用户在设计高维流式方案时有更多的选择，降低配色的难度，是多色流式理想的实验搭子。

数据来源：

A 43-Color Human Immunophenotyping Panel Using StarBright^™ Dye–Conjugated Antibodies | Bio-Rad

想要了解更多 StarBright染料的产品信息和实验方案，欢迎Bio-Rad官网：bio-rad-antibodies.com/StarBright 或扫码咨询～ 让你的流式实验告别繁琐，精准高效！