Western Blot简介
今日小编就给大家分享一下WB
实验中各种问题及应用对策
希望给您的实验带来实实在在的帮助~
WB问题汇总及解决方法
问题
|
可能原因
|
解决方法
|
条带形状不好看
|
胶凝的不均匀，聚合不好
|
灌胶前将溶液充分混匀
|
凝胶下面有气泡
|
电泳前先将气泡赶走
|
|
缓冲液陈旧，成分改变
|
重配
|
|
电泳时温度过高
|
降低电流或电压
|
|
电极不平衡或者加样位置偏斜
|
调整电极和加样
|
|
样品中含有不溶性颗粒
|
样品充分搅拌混匀
|
|
某些样品盐浓度较高
|
除盐或将样品盐浓度调成一致
|
|
无条带或条带较弱
|
蛋白降解 |
样本于-80℃保存，避免反复冻融，提取时保持低温状态，加入优质的蛋白酶抑制剂
|
目标蛋白含量低
|
检测阳性对照，增大上样量
|
|
抗体失活 |
使用新配的抗体，避免重复使用
|
|
抗体稀释不正确
|
增加或减少稀释倍数
|
|
一抗不适用
|
确认一抗应用范围有WB，样本种属为适用种属
|
|
二抗使用错误
|
检查二抗的目标种属是否为一抗种属
|
|
洗膜过度
|
减少洗摸时间
|
|
转膜异常
|
转膜后进行染色，确认转膜效率
|
|
化学发光底物失效
|
换用新鲜试剂
|
|
杂带多
|
目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带
|
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过修饰确定蛋白实际大小
|
样本处理过程中目的蛋白发生降解 |
加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作
|
|
杂蛋白多
|
处理目的蛋白
|
|
抗体特异性不强
|
使用特异性强的抗体
|
|
抗体孵育时间过久
|
减少抗体孵育时间
|
|
二抗与抗原有交叉反应
|
选择合适的封闭物
|
|
二聚体或多聚体存在
|
增加蛋白质变性过程及强度
|
|
底物显色与曝光时间过长
|
缩短显色及曝光的时间
|
|
蛋白条信号弱
|
样品上样量不足或目的蛋白浓度过低
|
加大上样量或浓缩样品
|
抗体浓度低
|
增加抗体浓度或延长孵育时间
|
|
封闭过度
|
减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型
|
|
显色剂失效
|
更换显色剂（吸取A、B液的枪头不可混用）
|
|
显色或曝光时间不足
|
延长显色或曝光时间
|
|
HRP 抑制剂
|
所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
|
|
转移不完全或过转移
|
可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流
|
|
电泳时不迁移或迁移速度慢
|
电泳液有误
|
使用适合该凝胶体系的电泳液
|
电泳槽接触不好
|
检查电泳槽和电极接触点是否存在氧化等异常
|
|
电泳液体积不足
|
按要求加入足量电泳液，检查内外槽液面
|
|
大分子量WB
|
膜孔径太小
|
更换孔径较大的膜
|
胶浓度太大
|
延长转膜时间
|
|
转膜时间短
|
延长转膜时间
|
|
转膜电压电流低
|
更换孔径较大的膜
|
|
转膜缓冲液配方不合适
|
调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度
|
|
高背景
|
洗膜不充分
|
增加洗液体积和洗涤次数 |
膜没有完全均匀湿透
|
使用100% methanol浸透膜
|
|
抗体浓度过高或洗涤不够
|
降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间
|
|
封闭物使用不当
|
检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭
|
|
封闭时间不够
|
室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜
|
|
化学显色底物过多
|
按说明书加入适量的显色底物
|
|
背景有黑色斑点
|
调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度
|
使用前过滤封闭试剂
|
HRP 偶联二抗中有聚集体
|
过滤二抗试剂，去除聚集体
|
|
暗背景有白色带
|
HRP 含量过高
|
降低酶联二抗的浓度
|
背景有不均匀的白色斑点
|
抗体分布不均匀
|
孵育抗体时使用摇床
|
感谢您阅读这篇文章
