寡核酸药物能够直接调控基因表达，被认为是继小分子药物，蛋白药物和抗体药物之后的新一代药物。寡核苷酸药物通常指由20个以内短链核苷酸组成，通过Watson-Crick碱基互补配对原理达到治疗疾病的目的，包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰核糖核酸（siRNA）、微小核糖核酸（miRNA）、核酸适配体（aptamer）等。
截止2023年，FDA已经批准了17个相关寡核苷酸药物。
见表1 .
表1 FDA Approved Oligonucleotide Drugs
根据网络数据整理：https://www.biochempeg.com/article/124.html
当前的主要制造工艺
单链寡核苷酸药物典型生产工艺主要包括四步：1 合成：常用固相亚磷酰胺化学合成 。2 断裂和脱保护：合成完成后，全长的产物与固相断裂，去除保护基团。3纯化 4 分离：沉淀，超滤，冻干。工艺流程见表2。
表2 单链寡核苷酸药物典型生产工艺
常用纯化技术及挑战
在固相合成之后，一些寡核苷酸并不是都能合成完整的全长核苷酸，那些不符合要求的失败序列短核苷酸（n-x）或者长核苷酸（n+x）需要去除，因为这些n-x与n+x核苷酸与目标产物性能非常接近，如何去除这些产品相关的副产物和失败序列，对纯化工艺来讲是非常大的挑战。所以，合成之后，如何选择合适的填料，优化一个好的适合产业化的工艺对于产品质量和生产都至关重要。
目前常用的寡核苷酸的制备级纯化层析主要是反向层析（RP-HPLC）和阴离子交换层析。通常,寡核苷酸都会包括5’-DMT保护基团，最后产品都会有一定的疏水性。RP-HPLC层析就是利用固相中的疏水性可以很好的结合含有5’-DMT的寡核苷酸，而那些没有DMT保护的核苷酸杂质由于结合力比较弱，可以被先洗脱下来，含5’-DMT的寡核苷酸用较强的溶剂洗脱下来，最后5’-DMT需要用酸去除，做到很好的分离。
离子交换层析由于原理简单，易于放大，是目前生物制品中常用的层析技术。阴离子交换层析可以与带负电荷的寡核苷酸结合。通常，先利用一定浓度的盐去无DMT保护的杂质，然后在柱上利用酸洗脱三苯甲基（Detritylation），最后利用不同的盐浓度把目的寡核苷酸分离纯化。
纯化后的样品需要脱盐和浓缩，常用的方法包括：沉淀或切向流过滤（TFF）。
图1 常用的寡核苷酸的层析方法
Nuvia HP–Q阴离子交换层析纯化ssDNA寡核苷酸
Nuvia HP–Q是Bio-Rad一款大孔径，小颗粒的高性能高分辨率阴离子填料，独特的基质优化与设计，在病毒，lgM等生物制品纯化中得到广泛的验证。
填料：Nuvia HP–Q阴离子填料，Bio-Rad
层析设备：NGC 10,Bio-Rad
样品：脱盐磷酸化的单链DNA寡核苷酸肽，具体如下：
缓冲液：
Buffer A：25mM arginine-NaOH, pH 11.7
Buffer B: 25mM arginine-NaOH, 2M NaCl, pH 11.7
主要分析方法：
变性电泳（15% TBE-urea Denaturing PAGE）
定量分析：Enrich Q column，Bio-Rad
层析过程优化及结果
ssDNA寡核苷酸在中性及以上pH都比较稳定，带负电荷。一般离子交换层析对于至40-mers长度的寡核苷酸有很好的分离效果。通过优化Nuvia HP–Q离子交换的pH，流速，洗脱方式，然后确定载量，再经过不同规模柱子的放大验证，最后确定工艺的条件，见表3。
表 3 Nuvia HP–Q层析工艺优化参数及结果总结
5ml Nuvia HP–Q阴离子层析柱分离ON1与ON2
对于寡核苷酸的纯化，有效的分离n与n-x，n+x产品相关杂质至关重要。通过采用优化后的条件，Nuvia HP–Q可以把ON1和ON2有效的分离. 该实验通过不同的比例的ON1和ON2混合作为样品，通过优化的条件，用Nuiva HP–Q阴离子填料对ON1和ON2分离纯化。从变性电泳结果显示，Nuiva HP–Q都可以很有效的把ON1和ON2做到有效分离,纯度可以达到97%，回收率90-93%。见图2和图3
图2 Nuvia HP–Q 纯化ON 1 层析图谱和变性电泳图
图3 Nuvia HP–Q 纯化ON 2 层析图谱和变性电泳图
25ml Nuiva HP–Q阴离子层析柱纯化ON1
样品：400mg 未纯化的ON1 ,稀释至0.23mg/ml
柱子：
Econo Alpha Glass Column （25×100mm）
流速：120cm/hr
图4 Nuvia HP–Q 放大纯化ON 1 层析图谱和变性电泳图
结论：
通过对pH，流速，洗脱方式，不同规模放大的优化和验证，Nuvia HP–Q可以有效的把ON1(20-mer)和ON2(21-mer)寡核苷酸分离，对寡核苷酸纯化过程中存在的关键的难分离的产品相关杂质（n-x ，n+x）做到很好的分离和去除，不同层析规模实验数据显示，纯度可以达到97%，回收率达到90%以上。Nuvia HP–Q作为常用的中低压阴离子填料，容易放大，使用成本低，可以满足各种规模的工业化生产。
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