衰老是一种生理现象。随着个体年龄的增长，细胞、组织和器官发生退行性变化，导致与衰老相关的疾病的发展和生命的终结。研究人员发现了研究抗衰老的新方法，也就是衰老细胞，如选择性去除衰老细胞、自噬调节等新颖的抗衰老方法。此外，还发现了一些与衰老相关的信号通路，包括胰岛素/IGF-1(IIs)、饮食限制、mTOR等。干预与衰老相关的信号通路可以有效地调节模型动物如线虫、果蝇和小鼠的寿命和与衰老相关的疾病。由于这些信号通路在物种间高度保守，预期这些结果对应用于人类衰老干预同样具有意义。近年来，从天然药物中提取的黄酮类化合物、多酚类化合物、皂苷类化合物、多糖类化合物等具有抗衰老的潜力。
自古以来，黄精属植物作为一种潜在的抗衰老资源被广泛接受，多糖和皂苷被认为是与其抗衰老活性相关的主要成分。目前，关于滇黄精皂苷(PKS)生物活性的研究较多，但关于其抗衰老活性的报道较少。华南理工大学姜建国教授团队以PKS为靶成分，探讨其抗衰老活性及其作用机制。采MRC-5细胞建立应激诱导和复制性衰老模型，研究PKS的体外抗衰老作用。以线虫为模型生物，探讨其体内抗衰老作用及其相关的信号通路和作用靶点。其研究论文 “Polygonatum kingianum saponins delay cellular senescence through SASP down-regulation and prolong the healthy lifespan of Caenorhabditis elegans by activating sir-2.1/autophagy”发表在一区TOP期刊Industrial Crops＆Products (IF=5.9)上。
细胞衰老是指增殖的细胞脱离细胞周期，进入永久性生长停滞的状态。衰老细胞的显著特征包括增殖能力下降、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性增加、细胞周期阻滞。该研究以体外42-46代增殖极限的MRC-5细胞为研究对象，建立细胞衰老模型。通过增殖活力、β-半乳糖苷酶活性和细胞周期指标评价PKS对复制性衰老（自然衰老）和应激性衰老（早衰）的影响。
D-半乳糖能够通过诱导氧化应激和凋亡等机制，加速生物体的衰老过程。研究人员用D-半乳糖来建立应激诱导衰老模型（图2）。结果显示，模型组的细胞存活率明显低于对照组，说明细胞增殖受到抑制。而PKS预处理的细胞则能够在应激条件下保持较高的增殖活力。其中H(0.50mg/ml)和M(0.10mg/ML)剂量组的细胞存活率与模型组相比有显著差异。SA-β-Gal是一种能够水解X-Gal（5-溴-4-氯-3吲哚基β-D-半乳糖-吡喃糖苷）产生蓝色沉淀的酶。细胞染色率越高，说明细胞衰老程度越强。图2B表明，D-Gal刺激的模型组细胞染色率高达50.13%，比正常对照组高出很多，说明细胞的SA-β-Gal活性增加，衰老速度加快，模型建立成功。而PKS预处理的样本组细胞染色率则都有所降低。M(0.10mg/ml)剂量组的染色率最低，为28.44±4.72%，与模型组相比有极显著差异(P<0.01)。
研究人员用复制衰老模型（图3 A）来检测PKS对细胞衰老的影响。结果发现，PKS能够显著提高细胞的增殖活力，其中M(0.10mg/ml)剂量组的效果最佳，细胞活力比对照组提高了30.14%。而低剂量组则没有明显效果。图 3B显示，衰老对照组的细胞染色率很高，说明细胞衰老程度很强，而H和M剂量组的PKS能够降低细胞的SA-β-Gal糖苷酶活性，减少染色细胞的比例，与对照组有显著差异。M剂量组的效果最好，染色率比对照组下降了24.28%。图2C和图3C表明，M(0.1 mg/mL)样品组的阳性细胞数量比衰老模型组和衰老对照组都少很多。流式细胞术检测结果(图2D/图3D)表明，两种衰老模型的细胞周期分布趋势相似。衰老模型组和衰老对照组的细胞都大量停留在G0/G1期，说明细胞增殖受到抑制。而PKS预处理组的细胞则有更多进入S期，说明细胞增殖得到促进。其中应激诱导衰老模型组的效果最明显，表明PKS能够有效缓解细胞衰老。
SASP是指一组由衰老细胞分泌的细胞因子，包括IL-6、IL-8等促炎症因子，MMPs等基质金属蛋白酶，CXCL-1、CXCL-10等趋化因子，HGF、TGF-β等生长因子。SASP不仅是衰老细胞的标志，也是导致衰老和衰老相关疾病的重要因素。研究人员用两种衰老模型来检测PKS对SASP的影响。图4A显示，在应激诱导衰老模型中，模型组的各种SASP因子的mRNA表达水平都比对照组高，其中IL-6、IL-8、MMP-3、CXCL-10有显著差异。而PKS预处理的样本组则能够降低细胞中IL-6、IL-8和CXCL-10的mRNA表达水平，分别比模型组低了25.71%、37.59%和35.06%。图4B显示，在复制衰老模型中，PKS也能够降低细胞中IL-6、IL-8、CXCL-10、HGF的mRNA表达水平，与衰老对照组有显著差异。而MMP3、TGF-β1的mRNA表达水平则没有明显变化。此外，研究人员还测定了细胞外液中SASP因子IL-6、IL-8、CXCL-10等的分泌水平，发现它们与mRNA表达水平的变化一致。图4C显示，在应激诱导衰老模型中，PKS预处理的样本组能够显著降低细胞外液中IL-6、IL-8和CXCL-10的分泌水平，与模型组相比有显著差异。图4D显示，在复制衰老模型中，PKS预处理的样本组也能够显著降低细胞外液中IL-6、IL-8、CXCL-10和HGF的分泌水平，与衰老对照组相比有显著差异。这些结果说明PKS能够有效地抑制SASP的产生和分泌。
寿命是衡量抗衰老效果的最直接指标。研究人员用寿命短的秀丽隐杆线虫作为模型生物，来评价PKS在体内的抗衰老活性。图5A和表2显示，对照组的线虫平均寿命为20.37±1.06 d，而PKS干预的不同剂量组的线虫平均寿命都有所增加。其中，浓度为0.125 mg/mL组的效果最好，平均寿命为23.20±0.88 d，比对照组延长了13.89%。脂褐素是一种随着年龄增长而在生物体内积累的色素，它反映了衰老程度的高低。图5B的荧光显微镜照片表明，对照组的线虫在15d时荧光强度很高，说明衰老程度很明显，脂褐素积累水平很高。而PKS干预的样本组则能够显著改善线虫的衰老状况，降低脂褐素积累水平，与对照组相比减少了49.79%。
抗氧化能力和抗应激能力是影响寿命和预防衰老相关疾病的重要因素。提高抗压能力是延长健康寿命的有效方法之一。研究人员用热应激/氧化应激抗性、体内抗氧化能力(SOD/CAT/MDA/ROS)等指标，来评价PKS对线虫抗逆性的影响。图6 A显示，在37℃的热刺激下，对照组的线虫存活率只有22.92±5.98%，而PKS喂养组的线虫存活率则显著提高到60.53±11.61%。在百草枯刺激下，PKS干预组的线虫存活率也比对照组(31.15±8.49%)高出75.85%。这说明PKS能够增强线虫的抵抗热应激和氧化应激的能力。此外，PKS还能够提高线虫体内的抗氧化水平。图6B表明，PKS喂养组的线虫体内的抗氧化酶SOD和CAT活性分别比对照组高1.09倍和1.54倍;而脂质过氧化物MDA的含量则比对照组低37.69%，有显著差异(P < 0.05)。ROS是一种反映氧化应激水平的指标，它在生物体内会积累并导致细胞损伤。图6 C和图6 D显示，当线虫生长到15天时，对照组的线虫体内的ROS水平很高，荧光强度很强，而PKS喂养组的线虫体内的ROS水平则比对照组低60.23%，说明PKS能够调节ROS的水平，减轻氧化应激。综上所述，PKS能够有效地提高线虫的抗逆性，有利于延长健康寿命。
为了探究PKS延长线虫寿命的作用机制，研究人员检测了PKS对一些重要的抗衰老相关基因在线虫体内的影响。结果发现，PKS能够显著提高线虫中sir-2.1和daf-16 mRNA的表达水平;增强daf-16的核转位，激活其下游靶基因sod-3。而缺失sir-2.1和daf-16的突变线虫在PKS干预下的寿命没有明显延长，说明PKS延长线虫寿命依赖于sir-2.1和daf-16。另一方面，eat-2是一种控制饮食限制途径的基因，eat-2突变线虫在PKS干预下的寿命有显著延长，说明PKS延长线虫寿命不依赖于饮食限制途径。
自噬是一种细胞利用自溶酶体降解受损细胞器和大分子的代谢过程，对维持细胞内环境的稳定有重要作用。适度增加自噬水平能够延长生物的寿命。由于皂苷类化合物被发现具有调节自噬的能力，研究人员想要探究PKS是否也具有自噬诱导的效果。lgg-1是线虫中与哺乳动物LC3同源的基因，是自噬过程中参与自噬小体形成的关键因子。bec-1是线虫中与哺乳动物beclin1同源的基因，是自噬过程中必需的主要因子，也与线虫的daur幼虫形成和寿命延长有关。研究人员用这两个因子来评估PKS对线虫自噬水平的影响。图7 qPCR结果表明，PKS喂养组的线虫体内lgg-1和bec-1 mRNA的表达水平分别比对照组高1.32倍和1.15倍，有显著差异(P < 0.05)。这说明PKS可能通过激活自噬通路来延长线虫寿命。图7 E表明，缺失bec-1的突变线虫在PKS干预下的寿命没有明显变化，与对照组没有显著差异(P> .05)，说明PKS延长线虫寿命依赖于bec-1。此外，研究人员还用表达LGG-1::GFP融合蛋白的突变线虫来监测自噬小体的形成情况。图9显示，PKS喂养组的线虫体内LGG-1::GFP斑点数量明显增多，说明自噬水平提高。这些结果表明PKS能够正向调控线虫的自噬水平，从而可能延长其寿命。
衰老状态的细胞，不再增殖，进入永久生长停止。衰老细胞的显著特征包括增殖能力下降，与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性增加，细胞周期阻滞该研究采用体外42-46代增殖极限的MRC-5细胞（人胚肺成纤维细胞）建立细胞衰老模型。通过增殖活力、β-半乳糖苷酶活性和细胞周期指标来评价PKS对复制性衰老(自然衰老)和应激性衰老(早衰)的影响。滇黄精皂苷能显著延缓应激诱导的MRC-5细胞的复制性衰老。细胞衰老水平的降低可能与PKS下调SASP因子水平的能力有关，有利于改善细胞微环境。在体内，PKS可延长线虫的寿命，显著减少脂褐素在线虫体内的积累。在PKS的干预下，蠕虫的应激抗性也增强，对热应激和氧化应激的耐受性增强，抗氧化酶(SOD/CAT)活性增强，脂质过氧化(MDA)降低，体内ROS积累减少。该研究小组推测PKS对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用可能与上调sir-2.1和增强daf-16的转录活性有关。此外，PKS的干预导致线虫自噬活性增加，这可能也是线虫健康寿命增加的原因之一。该研究揭示了PKS在抗衰老方面的优势，PKS可通过多种途径发挥作用。同时PKS还具有良好的血糖、脂质调节作用，有利于预防和治疗年龄相关疾病。因此，PKS作为一种潜在的抗衰老活性物质值得深入探索和开发。
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华南理工大学食品科学与工程学院姜建国教授为本文的通讯作者。
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编辑：周茜
审核：刘京晶