聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)是一种用于扩增特定DNA 片段的分子生物学技术，即DNA片段的特异性体外扩增过程，其特异性依赖于与 目的DNA片段两端互补的寡核苷酸引物。PCR基本原理为双链DNA在高温下发 生变性解链，当温度降低后又可以复性成双链，通过温度变化控制DNA的变性和 复性，加入引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)及相应缓冲液， 完成特定DNA片段的体外复制。
聚合酶链式反应法按原理和用途可分为PCR法、实时定量PCR法 (Quantitative real-time PCR，qPCR)等。PCR法系利用供试品中一段特征DNA 片段设计引物进行PCR扩增，并通过比较供试品组和对照组PCR产物片段大小或 数量进行结果判定的核酸检测方法，也可结合限制性内切酶酶切多态性技术 (Restriction fragment length polymorphism，RFLP)或核酸测序技术对扩增产物 进行测定，主要用于动、植物源性中药材和饮片，原材料，中间体，原料药与辅 料等种属鉴定，也可用于其它药品质量控制中特征DNA片段的检定。
1.对仪器的一般要求
包括可对温度进行连续控制的聚合酶链式反应分析仪(Polymerase chain reaction analyzer，简称PCR仪)、具有稳压直流电源电泳仪和平板电泳槽、紫外凝 胶成像仪(或紫外透射仪)等。
2.对PCR体系的一般要求
包括耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、引物、模板等。组成PCR体系的 试剂可采用自制、商品化试剂或为供试品检测设计的专用试剂盒，配制和使用过 程中应避免污染。自制试剂应尽量现配现用并经验证后方可使用，商品化试剂和 专用试剂盒需经过质量确认，并严格遵照说明书使用和储存。
3. 方法适用性试验
进行聚合酶链式反应时，应进行方法适用性试验，若测定条件以及供试品来 源、部位、加工、制备工艺、干扰物质、储藏等因素可能影响测定结果时，应重 新对所用方法的专属性等进行确认。
利用阳性对照、阴性对照、空白对照按“4. 测定法”进行方法适用性试验。 阴性对照可根据实际情况选择已知不含待测动植物源性成分的样品，检测结果应 无 DNA 条带或 DNA 条带数量与位置与阳性对照不一致。
采用商品化试剂或试剂盒进行供试品前处理、模板 DNA 制备、核酸扩增和 反应产物检测时，应按说明书操作，并符合试剂盒说明书中的质量控制及方法适 用性要求。
4.测定法
(1)供试品前处理
供试品取样应有代表性，取样量和取样部位可按各品种项下的规定或按物料 和不同生产阶段产品的检验要求。除另有规定外，可采用适宜方式对供试品进行 前处理，如依次用75%乙醇、无菌水清洗擦拭表面以消除交叉污染或细菌污染。 固体供试品应用乳钵或研磨仪充分研磨使成粉末，必要时可加液氮适量辅助研磨。 液体供试品应充分混匀。
(2)模板制备
按各品种项下规定或按物料和不同生产阶段产品的检验要求，提取供试品模 板DNA，模板DNA的质量和浓度应满足核酸扩增的基本要求。
(3)引物
根据样品来源物种的特征 DNA 片段设计引物。
中药材和饮片引物序列见各品种项下的规定。
动物源性生化药和辅料，除另有规定外，猪、牛及羊源性成分的种属鉴定应分别采用下列引物:
猪源性成分鉴定引物:
上游引物(PidF):5’-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3’;
下游引物(PidR):5’-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’。
牛源性成分鉴定引物:
上游引物(BidF):5’-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3’;
下游引物(BidR):5’-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3’。
羊源性成分鉴定引物:
上游引物(SidF):5’-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3’;
下游引物(SidR):5’-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3’。
(4)核酸扩增
除另有规定外，核酸扩增可采用PCR反应或PCR-RFLP反应进行，操作如下:
PCR反应 PCR体系应由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP，含脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L)、引物溶液(10~30 μmol/L)、 耐热Taq DNA聚合酶(具有5'→3'聚合酶活性)1~2.5 U及其缓冲液(含镁离子)、 模板和无菌水组成，总体积为20~30 μl。
扩增程序应包括变性、退火、延伸三个基本步骤，还可包括预变性、终延伸。 预变性时间一般为94°C保温3~5分钟，对于鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例较高的品种， 可适当延长预变性时间至10分钟或升高预变性温度至98°C。PCR循环一般分为三 步或两步，反应循环次数一般在30~40次，退火温度一般在45~65°C。当PCR反 应产物长度小于500 bp时，退火延伸时间一般在20~45秒。延伸温度一般为72°C 或68°C，可根据使用的Taq DNA聚合酶特性决定。
PCR-RFLP反应 在PCR反应完成后，取扩增产物，利用限制性内切酶进行 酶切反应。酶切反应体系由限制性内切酶及其缓冲液、扩增产物和无菌水组成， 总体积为20 μl，其中限制性内切酶一般为5~15 U，扩增产物一般为5~10 μl。依 据限制性内切酶种类选择适宜反应温度进行酶切，酶切反应时间通常为2~4小时， 快速限制性内切酶的反应时间不超过1小时。
(5)反应产物检测
按琼脂糖凝胶电泳法(核酸检测用)进行反应产物检测。对于片段小于1000 bp的产物，制备的琼脂糖凝胶浓度应在1~3%之间。选择合适的DNA分子量标准 同时进行琼脂糖凝胶电泳，DNA分子量标准应含有用于结果判定的分子量条带。
(6)结果判定
阳性对照 除另有规定外，中药材或饮片应选择对照药材作为阳性对照，动 物源性生化药和辅料应分别选择与供试品类型一致且种属来源明确的药用原材 料、中间体、原料药或辅料作为阳性对照。
空白对照 以无菌水代替供试品。
结果判定方法 分别取供试品、阳性对照和空白对照同法试验，阳性对照的 DNA 条带位置和数量应符合规定，空白对照中应无 DNA 条带。当供试品琼脂糖 凝胶电泳图谱 DNA 条带数量与位置与阳性对照一致时，结果判定为阳性。
【附注】
1. PCR 须在满足核酸检测基本条件的分子生物学实验室中进行;试剂配制 和储存、前处理和模板制备、PCR 扩增和产物分析等功能区域应参照《实验室质 量控制规范-食品分子生物学检测》(GB/T 27403)予以分隔。
2. 实验室生物安全和污染废弃物的处理应符合《实验室生物安全通用要求》 (GB 19489)。
3. 检测人员需经上岗培训和在岗持续培训，要求掌握聚合酶链式反应相关 专业知识和技能、实验室管理要求，能独立熟练地操作。