报告基因（reporter gene）
应用场景
01
利用Luc/EGFP稳转细胞株，建立可实时观察的小鼠移植瘤模型
02
通过CRISPR/Cas9原位敲入EGFP，构建报告细胞系用于药物筛选。
APOBEC3B（A3B）是一种DNA编辑酶，在多发性骨髓瘤和各种其他癌症中诱导基因组DNA突变。为了方便研究A3B的功能，Yamazaki等[3]通过CRISPR/Cas9技术在A3B的3'端敲入了3xFlag-IRES-EGFP，构建了3种骨髓瘤细胞（U266、RPMI8226、AMO1 ）的A3B报告细胞系。通过靶向A3B基因的shRNA慢病毒进行敲降验证发现：当A3B mRNA下调时，EGFP荧光强度也随之降低，这证实了报告细胞模型的可行性，可用于后续抗癌药物测试（图5）。
图5. EGFP敲入A3B基因打靶图
03
用Luc/EGFP检测启动子表达活性
相比于传统的Western Blot、ELISA等方法，报告基因可以在活体中更为直观地监测目标基因表达水平或启动子活性。一般采用在启动子序列后插入荧光蛋白/荧光素酶的方式对进行监测。如：Nina Solberg和Stefan Krauss[4]将mTcf3启动子片段克隆到含有Fluc cDNA的pGL3-basic报告载体中，通过对比萤火虫荧光素酶活性与内参海肾荧光素酶的活性研究小鼠胚胎衍生神经干细胞（NSC）中克隆的mTcf3启动子DNA片段的活性，并发现在4.5 kb和3.5 kb启动子片段之间的截断片段中存在抑制启动子活性的调控元件（图6）。
图6. 不同长度mTcf3启动子活性分析-荧光素酶值
04
用双荧光素酶报告系统研究miRNA与3’UTR的作用
目前研究miRNA靶基因的常规思路为：利用基因预测数据库等生物信息学方法预测miRNA的靶基因为研究提供思路，再通过双荧光素酶报告系统进行验证。双荧光素酶报告系统验证这一步需要在载体上将目的基因3’UTR序列连接至荧光素酶3’端上，通过比较miRNA过表达前后发光强度的改变来确定与miRNA作用的靶基因。如：Marcos等人 [5]经表达数组分析将GSK3B假定为miR-548q和miR-1185-1减肥干预的靶基因，并用双荧光素酶报告系统进行验证。他们在萤火虫荧光素酶基因下游克隆了GSK3B特异的3’-UTR结合区，并构建载体与miR-548q、miR-1185-1模拟物共转染进HEK-293T细胞中，验证了GSK3B为miR-1185-1的靶基因（图7）。
图7. GCK3B与miR-548q/miR-1185-1的结合分析
此外，报告基因在蛋白质相互作用、RNA干扰研究、阳性克隆筛选等方面也有应用。在上述案例中，我们发现，报告细胞系从表达基因上分两种，一种荧光素酶报告基因，另一种是荧光蛋白报告基因。从构建方法上也分为两种，一种是过表达稳转，另一种是原位敲入（Knockin，KI），这两种报告基因和构建方法有何差别，如何选择呢？小源给大家整理了以下干货内容：
选择策略
荧光素酶相较于荧光蛋白具有灵敏度高、背景干扰低、荧光强度高穿透力强、且容易定量的优势，较常用于启动子活性检测、miRNA功能研究，小鼠移植瘤模型构建等。而荧光蛋白的优势主要为观察方便不需要加底物、毒性低、多种颜色荧光可供选择、图像直观漂亮，适用于多基因报告系统，常用做稳转细胞Marker、内源基因示踪标记、蛋白定位标记及活体成像（一般需要把小动物毛发剔除降低背景干扰）。总体的说，在大部分情况下这两种报告基因都可以使用，具体可以结合需求与优缺点进行选择，但也有很多研究者采用荧光素酶与荧光蛋白相结合共表达的方式构建多功能报告细胞。而关于构建方法，一般来说内源基因示踪和蛋白定位等需要采用原位KI的方式构建，其他应用采用过表达稳转株即可满足实验需求。
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参考资料
[1] 翟向明, et al."携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用." 生物技术 28.01(2018):71-76. doi:10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.01.0013.
[2] 魏淑珍,etal."EGFP标记的人肺癌裸鼠原位移植模型的建立." 中国肺癌杂志 13.07(2010):670-675.
[3] Yamazaki H, Shirakawa K, Matsumoto T, et al. APOBEC3B reporter myeloma cell lines identify DNA damage response pathways leading to APOBEC3B expression[J]. PloS one, 2020, 15(1): e0223463.
[4] Solberg N, Krauss S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 2013;977:65-78. doi: 10.1007/978-1-62703-284-1_6. PMID: 23436354.
[5] Garcia-Lacarte M, Mansego ML, Zulet MA, Martinez JA, Milagro FI. miR-1185-1 and miR-548q Are Biomarkers of Response to Weight Loss and Regulate the Expression of GSK3B. Cells. 2019 Nov 30;8(12):1548. doi: 10.3390/cells8121548. PMID: 31801236; PMCID: PMC6953011.
撰稿人：陈晓珺
审核人：黄秋凤