转染是细胞实验中广泛使用的技术，通过转染可将外源核酸（DNA、RNA等）引入真核细胞，从而对基因的产物或其功能进行研究，是基因编辑细胞构建必不可少的步骤。然而转染效率不高的问题，总是困扰着许多新手小白，时常也会令颇有经验的细胞培养达人感到头秃。
其中细胞和载体大家相对来说比较熟悉，今天小源主要从第3点转染方法和试剂着手，给大家进行总结和分享。
首先，我们来盘点一下细胞转染都有哪些方法？按照转染的原理，大致可分为物理介导（如电穿孔法、显微注射法、基因枪法）、化学介导（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、阳离子聚合物介导法等）和生物介导（主要是各种病毒）三类。其中实验室最常用的主要有物理介导的电穿孔法、化学介导的脂质体法和生物介导的慢病毒法。
脂质体法
脂质体通过表面的正电荷与核酸磷酸基团的负电荷相互作用形成内包DNA分子的复合物，复合物表面带正电，会被带负电的细胞膜所吸附，进而通过融合或细胞内吞完成外源DNA分子的导入，是目前实验室最方便的转染方式之一。具体过程分为几步：
图1.脂质体法转染过程示意图[1]
电穿孔转染法
电穿孔法通过高强度电场引起细胞膜电位变化，瞬时提高细胞膜通透性，使细胞膜上产生可逆性小孔便于外源核酸的进入（图2），适用于几乎所有类型的细胞，是目前一种较为强大的转染方式。目前市面上比较常用的电转仪品牌有Thermo的Neon、Lonza的Nucleofector系列、Bio-rad电转系统，还有后起之秀Celetrix等。
图2.电穿孔原理[2]
慢病毒转导法
慢病毒属于逆转录病毒科，能够转导非分裂细胞和分裂细胞。人类免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 是研究得最多的慢病毒。具体过程分为几步：
图3.慢病毒生产和转导过程[3]
了解了三种转染方法的基本原理，接下来小源还帮大家归纳了它们各自的优缺点。
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转染 方法 |
优点 |
缺点 |
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脂质 体法 |
1）操作简便、可重复性强。 2）转染效率高、细胞毒性较低； 3）无免疫原性 |
1)对细胞有选择性，转染效率受细胞类型影响； 2)转染需除血清 |
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电穿 孔法 |
1）适用性广，高灵活性； 2）效率高，可快速转染大量细胞。 3）功能强大：可以转染大片段载体，还可以将蛋白、糖类、染料等多种大分子物质导入细胞中。 |
1）需要特殊设备； 2）对细胞伤害较大，死亡率较高； 3）细胞、DNA用量大。 |
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慢病 毒法 |
1）适用性广，可转难转细胞。 2）转染效率高 3）稳定表达 |
1）基因插入大小受限 2）对于基因编辑需求，存在有痕整合 3）生物安全问题 |
那么问题来了，如果你刚拿到一种新的细胞，怎么确定使用哪种转染方法呢？
1. 了解细胞：首先，要从细胞供应商或网上查询细胞背景，了解细胞的来源、特性、培养条件、代次和增殖时间等信息，对细胞有个初步的了解。
2. 参考转染案例：找到成功的转染案例做参考可以让你少走弯路！一方面可以跟转染试剂供应商或电转仪器供应商沟通，询问对方是否有做过该细胞转染测试，效率和参数是怎么样的。另一方面可以在网上检索文献资料，看是否有人对该细胞进行过转染操作，使用的什么方法，操作流程是怎样的，转染效率如何。最后结合实验室的具体情况，优先选择现有仪器和试剂可满足的转染方法进行效率测试。
3. 预实验：做好以上准备，我们就可以开始预实验摸索最佳转染参数了，一般使用带荧光标记的载体进行转染率的验证。按照事先查好的资料或者供应商提供的转染protocol对细胞进行转染测试，测试时一般测多组实验参数（比如脂质体法测DNA与转染试剂不同用量比例、电穿孔测试不同的电转参数，慢病毒法测试不同的MOI），转染24h-48h后观察转染率，选择效率最高且细胞状态良好的一组进行后续正式实验。如果最高的一组转染效率都不足30%，排除操作问题的情况下，可能是该方法不适用于这株细胞，建议更换其他转染方法。
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参考文献：
[1] https://www.mirusbio.com/transfection
[2] Du X, Wang J, Zhou Q, Zhang L, Wang S, Zhang Z, Yao C. Advanced physical techniques for gene delivery based on membrane perforation. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1516-1525. doi: 10.1080/10717544.2018.1480674. PMID: 29968512; PMCID: PMC6058615.
[3] Maes M E, Colombo G, Schulz R, et al. Targeting microglia with lentivirus and AAV: Recent advances and remaining challenges[J]. Neuroscience letters, 2019, 707: 134310.
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