CRISPR/Cas9助力攻克癌症肿瘤“大魔王”—

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CRISPR/Cas9助力攻克癌症肿瘤“大魔王”——KRAS

源井生物

2022-10-27

导读：KRAS、EGFR、BRAF等热门基因位点突变细胞株定制仅￥2.18万！

KRAS基因是人体内的一个正常基因，但其突变常发生在各种类型的肿瘤中，大约有30%的癌症患者基因组中都存在KRAS基因突变，其中包括90%的胰腺癌，50%的结肠癌和25%的肺癌。

KRAS

Figure 1: KRAS突变在不同类型癌症中的突变比例，数据来源于AACR GENIE 9.0公共数据库^[1]

但KRAS缺乏经典的药物结合位点，且活化的KRAS蛋白与GTP的结合具有皮摩尔级亲和力，相关的小分子药物需要拥有比传统阻滞剂更强的结合力才能竞争成功，故用药物靶向KRAS突变体是件极具挑战的事。

到目前为止，科学家针对KRAS做出了很多努力，随着Amgen公司的KRAS G12C抑制剂（AMG-510）获得FDA批准上市，终结了KRAS不可靶向的“魔咒”，并揭开了KRAS抑制剂研发的序幕，寻找新的癌症治疗靶点成为越来越多研究者们的课题。当然，设计直接针对KRAS的抑制剂是较难的，所以许多科学家将精力放在了研究KRAS的上游调控因子或下游效应因子靶向药的靶点上。

靶向KRAS突变的新药开发离不开疾病模型的构建，点突变细胞模型的构建能揭示KRAS基因相关的细胞生物学原理，促进人类进行疾病预防、新药开发和临床治疗，为人类生命健康发展保驾护航。下面我们将从目前KRAS靶向药研发思路、点突变细胞在KRAS突变研究上的应用案例2个方面展开讨论，希望能给大家的研究带来一些思路。

KRAS基因突变的癌症治疗药物研究思路

上文有提到用药物直接靶向KRAS是十分困难的，因此研究人员在过去40年里一直努力找寻相关间接途径，并摸索出几种可行性高的研究思路：包括减少KRAS的表达、中断 KRAS 的膜定位、干扰 KRAS与其效应器之间的相互作用、抑制上游和下游信号以及合成致死方法等，下面就简单介绍一下目前KRAS靶向药研发的常见思路：

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选择性抑制KRAS突变

设计针对KRAS突变具有良好特异性的抑制剂，从而降低KRAS突变体的表达，从源头上抑制持续激活状态的KRAS突变体带来的癌变。

抑制法呢酰基转移酶活性

KRAS蛋白的生物激活需要与膜结合，通过抑制法呢酰基转移酶活性可以抑制KRAS蛋白的法呢酰基化，进而减少KRAS蛋白定位到细胞膜上，达到中断KRAS膜定位的目的，因此法呢酰基转移酶也是开发KARS突变相关的癌症治疗靶点。

设计针对KRAS-SOS结合区域的抑制剂

KRAS的正常激活，需要SOS蛋白参与。因此，另一个靶向药物的设计思路是：针对KRAS-SOS结合区域设计靶向抑制剂。

Figure 2: KRAS (G12C)抑制剂的研究进展及化学结构

基于“间接途径”这一突破点，近年陆续有KRAS抑制剂研发的好消息——AMG-510的上市，用于治疗至少经过一次系统治疗的KRAS G12C突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者；Mirati Therapeutics公司有2款KRAS抑制剂的效用分别在临床和癌症模型中得到印证；Revolution Medicines公司也有1款KRAS抑制剂在癌症模型中表现出良好的抗癌活性。所以科研人员对KRAS的研究热情也持续上涨。

KRAS点突变细胞应用案例分析

细胞模型是人类疾病研究中最常用的工具，可应用于靶点验证、靶标发现以及药物筛选等研究，有助于全面认识疾病的本质，为人类战胜恶性肿瘤以及开展更深入的研究提供有效手段。下面将分享一些KRAS点突变细胞在靶点研究上的应用案例。

KRASG12C突变对不同信号通路介导的翻译机制的影响

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在肺癌中检测到的EGFR(15-50%)或KRAS(20-30%)致癌突变通过激活MAPK和/或PI3K/AKT/mTOR信号通路，这些激活的信号通路靶向重要基因的翻译起始因子。KRAS主要通过G12、G13和Q61位点的突变导致出现即使在没有胞外刺激的情况下也发生异常的信号转导。KRAS^G12C是肺腺癌中最常见的致癌突变之一，是一个很有前途的小分子抑制剂治疗靶点。KRAS致癌信号通路负责调节肿瘤微环境，其中翻译因子是最显著的下调靶点之一。有研究报道，对整合了可诱导的KRAS^G12C表达系统的EGFR野生型CL1-5和A549细胞进行分析发现，CL1-5细胞中mTORC2和NF-κB参与的cap依赖性翻译功能受损。而含有KRAS^G12S突变的A549细胞可通过招募mTORC1、c-MYC和eIF4F复合体促进cap依赖性的翻译^[2]。通过mTORC1/p70s6k非依赖性的方式延长KRAS^G12C的诱导后，CL1-5细胞的翻译率得到了恢复。研究结果表明KRAS^G12C信号在不同程度上影响着翻译机制的调节。这些点突变细胞株的构建以及研究结果可以为KRAS基因突变的分子机制和下游表型事件提供更多的参考，并促进当前KRAS特异性靶向药开发提供新的思路。

Figure 3: A549和CL1-5 KRASG12C tet诱导点突变细胞株的表型^[2]

验证KRAS^G12C-G12V双突变及KRAS^G12F对G12C特异性抑制剂的抗性^[3]

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KRAS^G12C共价抑制剂的诞生是RAS突变癌症治疗的重要里程碑，故其对于非小细胞癌（NSCLC）的治疗也意义重大。Vaclova等人对非小细胞癌中是否存在与G12C突变共发生的其他KRAS突变、这种共突变是否会影响细胞对G12C特异性抑制剂（AZ'8037）的敏感性展开了研究。经过对SELECT-1 3期研究（NCT01933932）的数据进行分析，他们发现在非小细胞癌中常与G12C突变（c.34G>T）共发生的突变为c.35G>T，而这种共突变有顺式和反式两种情况——顺式的共突变会产生G12F突变KRAS蛋白，反式的共突变会产生G12C、G12V两种突变KRAS蛋白。

Figure 4. KRAS G12C（c.34G>T）与NSCLC患者中其他KRAS突变共发生情况分析

而后，为验证共突变是否会影响G12C特异性抑制剂的效用，Vaclova等人使用CRISPR/Cas9技术在NSCLC细胞系中引入c.35G>T突变，构建出KRAS^G12C-G12V双突变及KRAS^G12F点突变NCI-H358细胞，并研究这两种细胞对G12C特异性抑制剂的敏感性。结果显示，相比于KRAS^G12C细胞系，上述两种存在共突变情况的细胞对G12C特异性抑制剂AZ'8037的敏感性显著下降。

该研究提示人们要对KRAS双突变的频率有所重视，应进行多区域肿瘤测序避免遗漏KRAS亚克隆突变体，也表明KRAS G12C抑制剂的不足，提示我们KRAS抑制剂研发仍有一段艰难的路需要走。

Figure 5. AZ’8037对KRAS突变细胞模型活力影响及免疫印迹分析

尽管几十年来的研究一直在强调KRAS突变是肿瘤发生和临床耐药的核心因素，但尚未找到KRAS突变的有效治疗方法，对KRAS突变进行研究变得迫在眉睫。同样与癌症肿瘤相关且容易突变的热门激酶基因还有EGFR、BRAF、PIK3CA、MET、NRAS等，目前已经有许多研究人员选择构建点突变细胞模型用于还原基因突变疾病模型，进行新药靶点筛选及验证。

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参考文献：

[1]Huang L, Guo Z, Wang F, Fu L. KRAS mutation: from undruggable to druggable in cancer. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):386.

doi:10.1186/s12943-022-01629-2

[2] Kyriakopoulos, George et al. “KRASG12C Can Either Promote or Impair Cap-Dependent Translation in Two Different Lung Adenocarcinoma Cell Lines.” International journal of molecular sciences vol. 22,4 2222. 23 Feb. 2021, doi:10.3390/ijms22042222

[3] Vaclova, T., Chakraborty, A., Sherwood, J. et al. Concomitant KRAS mutations attenuate sensitivity of non-small cell lung cancer cells to KRAS G12C inhibition. Sci Rep 12, 2699 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06369-3

撰稿人 | 徐甜

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