干货必看！如何提高CRISPR文库筛选靶点的准确性？

图1.人全基因组文库质粒A库（双质粒系统）

覆盖率是NGS检测到的gRNA数量除以文库理论清单中sgRNA的数量，最大值为100%，越接近100%越好。

均一性是指不同gRNA的丰度差异，理想的文库每条gRNA丰度一致，实际文库gRNA丰度都会存在差异，用skew ratio表示，是累积分布达到 90% 时对应的gRNA数目与累积分布达到10%时对应的比值（即90%分位数和10% gRNA数目的比值），最小值为1，也是越接近1越好。

图2. 均一性斜率

如果文库覆盖率太低，还没开始筛已经少了一大波sgRNA，要是你的理想靶点恰好在里面，就失之交臂了。或着均一性太差，大量的sgRNA只有极低的读数，在实验过程中容易丢失，也会影响最终的结果。

那么文库质粒的覆盖率和均一性要如何保障呢？目前常用的文库基本都有现货产品，免去了定制，只需要扩增，扩增环节一定要注意：

1）选择电转方法，根据文库大小重复多次电转操作；

2）选择转化效率≥10⁹cfu/ug超级感受态细胞用于电转； 

3）计算转化效率，要求菌落数量≥文库gRNA数量X500。

和常规构建稳转株时感染病毒不同的是，文库病毒感染细胞时，感染效率并不是越高越好。因为病毒量多时，一个细胞可能进入多个sgRNA病毒，最终富集的细胞难以分辨是哪条sgRNA起的作用，可能导致分析结果的不准确性。

图3.不同感染效率对应每个细胞整合的

sgRNA拷贝数^[1]

从图中可以看出，感染效率越低，单个细胞中出现2个及以上的sgRNA拷贝数情况越少，但是太低的转染效率反过来也会对感染时所需的细胞数量要求过大，所以需要选择一个折中的数据。绝大部分文献推荐的感染效率为30%，即Infect MOI为0.3。

很多同学都有疑问，我应该要用多少的细胞量来做文库筛选实验呢？

举个例子，如果一个文库病毒包含30000条sgRNA，根据上一步的感染效率要求，需要控制仅30%的细胞被病毒感染成功，那么假设感染成功的细胞恰好是30000个，未感染的细胞则是70000个，感染时总的细胞数量就需要100000。这个极端的案例中，感染后的细胞数量正好和sgRNA的数量一致，这不仅要求每个细胞只进1种病毒，还要求1种病毒只进一个细胞，从概率学的角度来看是几乎不可能发生的。即使能，每种sgRNA只有一个细胞，也很容易在传代过程中丢失。目前关于CRISPR 筛选的指南建议文库的细胞实验覆盖度在200X到 1000X之间，但缺乏准确的指示应在给定文库中使用哪种覆盖度^[2]。

以下汇总了近几年文库筛选文献中使用的细胞覆盖度，包括全基因组文库和亚文库，正向筛选和负向筛选，涵盖肿瘤耐药性研究、合成致死基因对、病毒感染靶点和解毒剂药物开发等应用。大部分是选择的500X覆盖度，也有200X，400X等。

表1.CRISPR文库筛选细胞覆盖度引文节选^{[3,4,5,6,7,8]}

为什么大部分文章推荐的是500X呢，研究人员根据细胞传代模型，当传代时细胞覆盖度低时（如50X），会导致每次传代随机丢失一些sgRNA，影响文库的分布和最终dropout和enrichment的错误解释，当细胞覆盖度＞500X时，这种噪声可以大大减轻（图4）。同样的道理，富集后提取细胞基因组以及最终的NGS测序也要保证相应的实验覆盖度。

图4.细胞传代覆盖度对文库分布的影响

精准的实验数据来自于每个环节的层层把握，一旦某个步骤不够严谨就有可能导致实验结果不理想，庞大的文库筛选实验尤甚。好啦，本期先分享这些内容，同学们对文库筛选还有哪些想要了解的，欢迎添加小源的微信跟我们交流。