KO效率低？蛋白残留？你的gRNA可能有问题!

图1 CRISPR/Cas9系统进行基因敲除

这些设计规则也许会让你觉得选择一个好的靶位点一定是万里挑一的，但假设你的目的基因的长度为1kb，那么在每8个核苷酸中就有1个潜在的靶位点，如果将gRNAs的序列限制在蛋白质编码区的5%-65%之内，还是会有许多不同的gRNAs序列可供选择。上述的这些参数虽然对gRNA做出了许多限制，但实际上它们反而为gRNA的设计提供了广泛而有效的基因组位点。因此，在指定的位置范围内选择出特异性最高的gRNA是十分可行的。

在有了足够多的选择之后，gRNA的筛选成本也要纳入考虑范围。毕竟为一个基因敲除实验选择合适的gRNA需要同时权衡最大化打靶效率和最小化脱靶效应之间的关系，这虽然听起来很容易，但做出最终的决定往往是十分困难的。所以，选择一个好用的gRNA设计工具会减少你的选择恐惧。

理论上，gRNAs的打靶效率与脱靶概率是可以用精密的生物信息学工具和一些评分规则来预测的。但目前还没有一个通用的评分系统能对gRNA进行相关参数的评分与推荐，因为不同的gRNA合成方式（合成、体外转录或慢病毒递送）以及靶点的动态方面（例如，由于染色质状态导致的可及性）都会影响预测评分的准确性。不过现在出现了一些在线gRNA设计工具可用来设计gRNA，这些工具在一定程度上能减少我们需要测试的gRNA的数量。目前国内常用的gRNA设计系统——“红棉CRISPR基因编辑系统”是完全由国人自主研发的，该系统是基于第一点中提到的gRNA设计标准对用于基因敲除的gRNA进行设计，因此它能给出十分切实可行的gRNA设计方案，在很大程度上降低了基因敲除后蛋白质残留的可能性，并大大减少了gRNA的筛选成本。（点击即可跳转）

但事实上，导致以上三种结果的原因不只有抗体的精度问题，更多的还是因为翻译重新启动和外显子跳跃这两种情况，因为这两种情况都会导致截短蛋白仍然表达即抗INDEL效应。

图2: 抗INDEL效应导致CRISPR基因敲除实验失败的细胞机制

图3: 翻译重新启动的机制

图4: Mechanism of exon skipping外显子跳跃的机制

可以看到，导致WB验证出现阳性结果的原因实在是太多了，为了确保构建的基因敲除细胞不再有什么隐秘的“惊喜”，我们可以事先进行一些预实验，来帮助我们制定避免上述蛋白残留的问题的打靶策略：

所以，在使用CRISPR技术前，一个经过了精密设计的方案是必不可少的，而后续的方案执行与实验结果分析都需要一个具有丰富的基因编辑经验的专业团队才能顺利完成的。目前源井生物已经对5000多个基因进行了基因敲除实验，并且都成功验证蛋白质水平的0残留，丰富的经验让我们能够对每个基因的敲除方案作出专业的评估与高效的执行。现在我们的细胞KO服务正在进行超值促销，低至1.68万元，失败全额退款，点击“阅读原文”即可了解活动详情。