干货丨教你如何分析CRISPR文库数据

NGS测序所得到的原始测序文件（raw reads）中，含有部分带接头、低质量的reads，为保证分析质量，需要先对raw reads进行过滤，得到clean reads。随后还需要根据Q20、Q30评估测序数据质量，通常，Q20 > 90% 或Q30 > 85% （图1）认为测序数据质量合格，若低于该数值说明测序质量低，数据误差大，需重新进行测序。

图1 测序数据质量评估

由于sgRNA文库质量、NGS建库以及测序过程中引入突变等因素的影响，所获得的clean reads 中有部分序列无法匹配到对应的sgRNA文库中。为了确保分析的有效性，需要先将clean reads中能匹配到sgRNA文库的reads进行数据比对，从而获取本次CRISPR文库筛选结果中的有效数据（mapped reads）。为了保证测序结果中数据的准确性和可信度，需要分析mapped reads 中的测序深度（mean depth），一般推荐测序深度在300x以上（测序深度 = mapped reads/sgRNA数）。

图2 sgRNA测序深度分析

对于CRISPR文库筛选结果，通常使用MAGeCK软件中的RRA（Robust Rank Aggregation）算法[1,2]对实验组和对照组中的sgRNA进行分析，从而找出差异基因。作为一种综合排名算法，RRA算法会对每个基因进行评分和排名，RRA得分越小，排名越靠前，表示该基因是靶基因的可能性越高。此外，在生信分析结果中，会同时分析正向筛选结果和负向筛选结果，正向筛选结果代表该基因在实验组中被显著富集，而负向筛选结果则说明该基因在实验组中显著丢失。

图3 RRA算法分析结果

筛选出的靶基因会进一步进行GSEA富集分析（图4）以及GO富集分析（图5），揭示差异基因所靶向的信号通路。

图4 GSEA富集分析

图5 GO富集分析

CRISPR文库作为一种大规模基因筛选的方法，无可避免地会产生一些假阳性的结果，因此在筛选靶基因的过程中，建议多挑选几个基因作为候选基因，并结合下游实验对候选基因进行验证。

如前所述，CRISPR文库筛选结果通常使用RRA算法进行分析，排名越靠前的基因，表示该基因是靶基因的可能性越大。在筛选靶基因的过程中，如无法对目的基因进行有效辨别，可以通过筛选排名前20或前30的基因作为候选基因，结合下游基因敲除或过表达实验进行验证。如Liu等人通过RRA算法rank排名找到靶基因Cop1^[3]。

图6 RRA算法排名筛选靶基因Cop1^[3]

首先，相信大家已经清楚FDR = Q value = adjusted p-value。P-value所代表的是发现某个基因在实验组和对照组中有显著差异的概率，而FDR代表的是错误发现率，也即所有发现中发生了错误所占的比例。简单来说，当p-value < 0.05时，说明该基因在实验组和对照组间存在显著差异的可能性大于95%，当FDR < 0.05时，说明前述判断为真的可能性大于95%。

通常，使用FDR < 0.05作为筛选条件所筛选出的基因是靶基因的可能性更大。然而，由于文库筛选基因数量庞大，往往需要单个基因的p-value < 1*10-7 才可使得FDR < 0.05，单纯使用FDR进行筛选，往往容易遗漏大量真阳性基因。因此，在绝大多数文库筛选案例中，并不会通过FDR，而是p-value来筛选目的基因。

LFC则代表实验组和对照组之间sgRNA差异倍数，当LFC > 1则代表针对某一特定基因实验组中sgRNA数量为对照组的2倍，当LFC > 2则代表该基因实验组中sgRNA数量为对照组的4倍，以此类推。

除了上述提及的通过排名的方式筛选目的基因外，研究者们也可通过p-value和LFC相结合的方法进行筛选潜在靶基因。如Guo等人通过p < 0.01 、LFC ≤ -2的条件筛选到靶基因CDC7^[4]。

图7 结合p-value和LFC筛选出靶基因CDC7^[4]

希望通过今天小源对 CRISPR 文库分析流程的系统性讲解，能帮助大家消除一些在筛选结果分析及靶点寻找方面的疑惑。后续若大家在实际操作中还有任何问题，欢迎随时与小源交流 。