乳腺癌简介
乳腺癌是女性最常诊断出的恶性肿瘤，也是全球女性癌症死亡的第二大原因，其研究和治疗进展一直是医学界关注的焦点[1]。根据肿瘤组织中受体分子的表达状态，乳腺癌可以分为：Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌[2]。其中，三阴性乳腺癌不表达常规的激素受体和HER-2，这使得传统的内分泌治疗和HER-2靶向治疗在这类患者中效果有限[3]。因此，需要更加深入研究乳腺癌，开发新型的治疗手段，为乳腺癌患者提供了新的治疗选择和希望。
图1 乳腺癌亚型及占比[2]
随着基因编辑技术的飞速发展，CRISPR-Cas9系统以其卓越的精确性和灵活性，为癌症研究领域带来了革命性的变化。而CRISPR文库作为该技术的一种应用，通过大规模筛选基因功能，为乳腺癌的研究提供了强大的工具。跟随小源一起探索CRISPR文库筛选如何助力乳腺癌研究，我们可能会收获新的思路和见解，从而更加有效地应用这个强大的工具！
乳腺癌耐药新靶点的发现-NUMEN
BRCA1基因是与遗传性乳腺癌高度相关的肿瘤抑制基因，其功能丧失会导致DNA双链断裂修复缺陷，使得细胞对PARP抑制剂（PARPi）特别敏感，但是发现肿瘤细胞可能对PARPi耐药[4]。Chen Bohong等人[5]通过全基因组CRISPR文库筛选发现了NUMEN这一基因，它在BRCA1缺失的乳腺癌细胞中对PARPi的抗性至关重要。NUMEN通过其结构特异性的核酸酶活性，促进了非同源末端连接（NHEJ）依赖的DNA双链断裂修复。这项研究不仅揭示了NUMEN在DNA修复和基因组稳定性维持中的作用，还为开发针对PARPi耐药乳腺癌的新型治疗策略提供了可能的靶点。
文库类型：全基因组敲除CRISPR文库（GeCKOv2 库）
转导细胞：可诱导表达CAs9的BRCA1−/−基因敲除MDA-MB-231细胞
筛选思路：体外加药筛选
筛选方法：在含有多西环素（doxycycline）的条件下培养细胞，以诱导Cas9的表达，然后加入PARP抑制剂奥拉帕尼（olaparib）进行筛选。
图2全基因组CRISPR筛选流程[5]
三阴性乳腺癌靶点的发现-Cop1
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种预后较差的癌症类型，对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应有限。而肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），在促进肿瘤生长和转移中起着重要作用。Wang Xiaoqing等人[6]通过两轮CRISPR文库筛选，最终鉴定出E3泛素连接酶Cop1是一个重要的调节巨噬细胞浸润和抗PD-1反应的基因。Cop1的敲除可以减少肿瘤相关巨噬细胞的浸润，增强抗肿瘤免疫反应，并提高对ICB治疗的反应。通过抑制Cop1可以改善TNBC的癌症免疫治疗疗效，这为开发新的癌症治疗策略提供了潜在的靶点。
乳腺癌风险基因识别新平台—CRISPR文库
Natasha K. Tuano等人[7]通过全基因组关联分析（GWAS）发现200多个与乳腺癌风险相关的基因，大多数候选致病突变位于非编码区，这些突变位点通过调控基因表达影响癌症表型。然而，精确定位靶基因并识别其表型是艰巨任务。为了克服这一挑战，他们进一步通过60个CRISPR文库筛选，最终鉴定出了20个高置信度的基因。这些基因通过促进乳腺细胞的增殖或调节DNA损伤响应来促进癌症的发生与进展。这一研究不仅展示了CRISPR文库筛选在准确识别风险位点基因靶点方面的能力，还证明了其高效性，为识别和增加乳腺癌风险相关的基因靶点提供了一个重要的平台。
小结
看完以上三个应用实例，我们不难发现，CRISPR文库在乳腺癌研究中具有多样性和灵活性。比如，在靶基因的选择上，不仅可以选择全基因组筛查，还可以选择其他方法筛选得到的大量基因。在细胞类型上，不仅可以使用野生型细胞，还可以选择基因编辑修饰的细胞以模拟特定基因突变的影响。在筛选方法上，可以是体外筛选，也可以是体内筛选，甚至可以采用体内和体外相互结合的筛选策略，以提高筛选的准确性和有效性。
总之，CRISPR文库技术为乳腺癌研究提供了个性化的、灵活的解决方案。根据具体的研究目标，可以对CRISPR文库进行个性化的调整和优化，从而筛选出置信度高的靶点，为乳腺癌的治疗开辟新的道路。
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