1、WB实验最重要的是什么？
答：安全！安全！安全！爱护身体，保护自己。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定带手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。
2、WB有什么优点？
答：灵敏，可达ng级，用ECL显色法可达pg级。灵敏，相对便宜且特异性高。
3、做WB时，同样的抗体在免疫组化能做出，而WB却不能？
答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和免疫组化。
4、WB中抗体可以重复应用么？
答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
5、DAB好还是ECM好？
答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家一般使用ECM。
6、磷酸化抗体的检测样本制备是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。
7、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。
8、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。
9、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？
答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。
10、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。
11、大分子量蛋白200KD或以上，在做WB要注意什么呢？
答：做200KD蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。
12、蛋白变性后可以存放多久？
答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
13、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。
14、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。
15、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了，但是不要超载。
16、一抗，二抗的比例是否重要？
答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉大部分的非特异性底色。
17、要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求？
答：主要是一抗要选择好。对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
18、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？
答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称抗原表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，蛋白煮后变性其构象会消失，仅剩下一级结构。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般我们做的时候没有这么复杂的考虑，多看看抗体说明书所注明的实验范围来做，这样省时省力
19、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21KD和66KD可以一起转，一起做。采用12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，可以根据你实验室师兄师姐的调节；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。
20、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉，其中TBST的T是Tween吗，浓度是多少？
答：T就是Tween，全称Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)，组成：8g NaCl，2.42g Tris base，加水800mL充分溶解, 加 500-1000μL 的 Tween-20，用HCl 调节pH 至 7.4，加水定容至 1L。
21、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？
答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：
a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
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