WB提完蛋白，跑完电泳下一步应该做什么？
众所周知在Western Blotting（蛋白免疫印迹）实验中，电泳之后的步骤就是转印。此步骤将蛋白从凝胶移动到合成膜上，并与膜相结合，形成印迹。
电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，该方法的原理是利用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。此过程中，将凝胶和膜贴合在一起之后在夹上滤纸放置在两个电极之间，然后在电极之间施加电压，蛋白分子在电场力的作用下迁移到膜上。电压及电极间距都会影响蛋白从凝胶中洗脱的速率。针对不同分子量的蛋白需要进行转印条件优化，以防止转印不足（蛋白不完全从凝胶中转移到膜上），或转印过度（蛋白穿透印迹膜造成损失）。
一. 转印膜的种类
1.1 聚偏二氟乙烯（PVDF）
PVDF 膜具有很强的蛋白结合能力（约为硝化纤维素的两倍），并且在通常的处理中不易破裂，因此可以用于抗体的剥离和重孵育实验。低荧光背景的PVDF膜结合了PVDF的优势，并且在很宽的波长范围内具有低自发荧光。在长时间曝光情况下，不会增加背景荧光水平，有利于检测微弱的荧光信号，是WB最常用的转印膜。
PVDF膜通常有0.45 μm和0.2 μm 两种孔径可供选择：
大多数免疫印迹实验，可使用0.45 μm孔径为 的膜；
而转印低分子量蛋白 (<20kD)，则建议用孔径0.2 μm的膜，因为低分子蛋白有可能穿过较大孔径的印迹膜。
1.2 硝化纤维素膜和增强型硝化纤维素膜
硝酸纤维素膜很容易在水或转印缓冲液中润湿，并且与多种蛋白检测方法兼容。无支持的硝化纤维素很脆，不建议用于抗体剥离及重孵育实验。
增强型硝酸纤维素膜是含有惰性支撑结构的硝酸纤维素膜。这种额外的支撑使膜具有更高的强度和弹性，可以用于抗体剥离及重孵育，并可承受高压灭(121℃)，依然保持硝酸纤维素的易润湿性。
二. 两种转膜方法（湿转，半干转）
2.1 湿转法
湿转，顾名思义，就是由滤纸，膜，胶组成的三明治泡在转膜液中完成。湿转耗费转膜液较多，操作相对复杂，效率不高，但适应广泛，对温度的控制较好，不容易出错。
参考：一般30kd以下转30min，30-70kd 60min，70-140kd转90-110min.转膜电流200ma，假设分子量大转膜时间比较长可垫多一层膜，防止转膜时间过长导致蛋白分子穿过第一层膜转到滤纸上。
2.2 半干转法
半干转，三明治在转膜过程中并没有浸没在转膜液中，但在转膜之前用相应的电转液浸泡滤纸，膜，胶一定时间。半干转转膜效率高，25到135kd蛋白都可大方跑出。
参考：转膜条件20-25V，1.0-1.5A，30min。
三. 转膜的流程
3.1 选择转印的方法及设备：传统湿转、半干转法。
3.2 准备转印缓冲液及试剂：准备足够的转印缓冲液，用于转印槽以及凝胶、膜的预平衡。
3.3 预平衡凝胶和膜：如有必要，用 转印缓冲液预先平衡凝胶和印迹膜。
3.4 组装凝胶和膜的“三明治”：将凝胶和膜放置在被缓冲液浸湿的滤纸之间，做成转印“三明治”。
3.5 转印过程：将“三明治”放入转印槽，并加入转印缓冲液，选择合适的转印条件，开始转印过程。
四. 转印经验分享
4.1 去除气泡
想要把蛋白质均匀的转印在膜上面需要三明治的各组件之间完全接触，尤其是凝胶和膜完全接触。气泡会导致膜上出现空白点，蛋白转印时会在气泡周围“流动”，因此请使用凝胶滚轮将这些气泡赶出！提示：梯度凝胶最好上下滚动，而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。
4.2 转印前的预平衡
湿转和传统半干转时，将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率，从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶，然后在转印缓冲液中平衡凝胶15分钟，平衡膜5分钟
4.3 避免膜变干
在转印之前和之后均需保证膜的湿润，从转印三明治中取出后，转印热量会使膜容易变干燥。对于PVDF膜尤其重要，因为PVDF膜是疏水的。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中，以免膜干燥。如果干了，可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿，而PVDF膜则需要在醇中重新活化。
实验所需试剂
| 货号 | 试剂名称-(GBCBIO) |
| G0993 | 10X Western转膜液|Transfer Buffer |
| G4037 | Tris-Glycine Buffer电转液粉剂 Western Transfer Buffer |
| H8055 | Western专用滤纸/转印滤纸 /Thick Blot Filter Paper |
| IPVH00010 | PVDF膜0.45 IPVH00010 |
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