WB操作中需要注意事项
所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
一般5×106就足够
2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可
3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高
不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的
3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象
4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下
样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。
可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定
3、转膜
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。
1）常用封闭液为脱脂牛奶（GBCBIO-232100）、牛血清白蛋白（BSA GBCBIO-0332）、无蛋白封闭液（GBCBIO-G7205）等
2) 封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时
3) 封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7
4) 个人经验：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换
一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。
答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度
2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度
3) 抗原过少：提高上样量
4) 抗体种属不兼容：一抗species reactivity中是否有需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配
5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等
6) 封闭过度或封闭剂不兼容：降低封闭剂浓度、缩短封闭时间，或者更换封闭剂种类
7) 底物出现质量问题：可以通过点杂交试验排除底物和酶活性问题
8) 抗体稀释液pH：注意检测pH是否在6-8
9）样品不表达该目的蛋白
10）转膜不足或过头：优化转膜条件
11）其它：PVDF膜、保鲜膜质量问题等
12）抗体质量：换口碑稳定的品牌抗体公司，如CST、Millipore、Abcam等
6）一抗条件过强：降低一抗浓度、缩短一抗孵育时间和改变温度等
7）抗体质量不佳：如特异性不好，建议购买品牌公司的抗体
13）ECL发光液本身因外源污染等原因存在很强的背景光，显影可以显示强的背景光，建议分装A和B液和更换发光液
14）缩短压片或曝光时间
15）膜没有完全均匀湿透，建议使用100% methanol浸透膜
21）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物
6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀
5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量
4）抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床