一.PCR简介
二.PCR是干什么的?
三.PCR的原理是什么?
我们知道DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制。
用简单的方式来理解PCR就像是 “心灵手巧的小姑娘学习织围巾” 在织围巾(PCR)的过程中，首先拆解原始织样得到元素织样(模板DNA)、起针(引物对)、毛线(dNTP)和针(Taq酶以及缓冲液体系)串起来，让DNA分子无处可逃。
四.PCR实验基本步骤
PCR反应准备工作
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10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物（终浓度） 各100～250μmol/L
引物（终浓度） 各5～20μmol/L
模板DNA 0.1～2μg
Taq DNA聚合酶 5～10 U
Mg2+（终浓度） 1～3mmol/L
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补加双蒸水 100 μl
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引物：(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。 酶：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。
dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP
模板：模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。
缓冲液：（其中需要Mg2+）
缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：
缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；
一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；
二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；
辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。
2.PCR引物设计
引物设计的基本原则
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
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PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
反应温度和循环次数
变性温度和时间 95℃，30s
退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”
循环参数设置
PCR反应步骤
DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
PCR反应特点
1.特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
2.灵敏度高
3.简便、快速
4.纯度要求低
PCR反应结果的检测
常见问题
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
实验所需试剂
| 货号 | 试剂名称-(GBCBIO) |
| R1105 | TRNsol/TRNsol RNA提取试剂 |
| D2105 | 组织/细胞DNA提取试剂盒 |
| D5105 |
Hpure 植物DNA提取试剂盒 |
| D3105 |
细菌DNA提取试剂盒 |
| P3711 | Long Taq DNA聚合酶 |
| P3511 | Taq DNA聚合酶 |
| D2314 | dNTP Mix |
| G3410 | 电泳缓冲液10 x Tris-MOPS-SDS Running Buffer |
| T2866 | Tris-硼酸-EDTA 缓冲液|5×TBE Buffer |
| G3470 | 电泳缓冲液10 x Tris-MES-SDS Running Buffer |
| G4566 | Tris-乙酸-EDTA缓冲液|50XTAE |
| 0288 | 氯化镁 | Magnesium Chloride, Hexahydrate |
| M3705 | DNA分子标准物DNA Marker IV|DNA Marker IV |
| G4550 | 6XDNA上样缓冲液|6XDNA Loading Buffer |
| P3411 | DNA扩增2xPCRmix Master|2xPCRmix Master |
参考文献：
2.百度百科《聚合酶链式反应》
3. 捷倍斯生物官网
品牌优势
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