1.什么是免疫组化？
免疫组化（ Immunohistochemistry， IHC），利用抗原与抗体特异性结合的原理使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。
一抗特异性识别目标抗原带 HRP（辣根过氧化物酶）的二抗特异性识别一抗HRP 与 DAB 反应后呈棕色从而显示出目标蛋白的位置，棕色越深，目标蛋白含量越高，通过软件分析，即可量化目标蛋白的含量。
免疫组化操作流程图解
图源自：https://www.51xxziyuan.com/53/9778.html
3.免疫组化操作步骤：
组织块制备成组织切片：需要用固定液固定组织，常用多聚甲醛、福尔马林、波恩固定液。
抗原修复、抗体杂交：固定液中含丰富醛基，能与蛋白质中的氨基交联，从而掩盖一些抗原表位，抗体无法结合，所以在抗体孵育杂交之前要做抗原修复。
显色、封片：一抗、二抗杂交完成后，使用 DAB 显色，盖玻片盖片。
免疫组化操作步骤
图源自：https://www.51xxziyuan.com/53/9778.html
免疫组化操作关键节点：
样品准备---抗原修复---封闭与抗体孵育---显色、封片---拍照---图像分析
（1）取材与固定
◆ 新鲜取材的组织，将组织切成直径不超过 5mm 的小块，4%多聚甲醛 PFA 固定液（PBS 配制，4℃预冷），4℃固定过夜；PBS 洗 3 次，每次 5 min。
◆ 组织越新鲜越好，最好一取下就放入预冷的固定液中；如果组织暴露在空气中一段时间，组织缺水，最后组织形态就会不好看。
4% PFA 可在适当分装后冻存在-20℃。（最好不要放在 4℃或室温，容易解聚，影响固定效果。固定液推荐用 PFA，最好不用福尔马林）
捷倍斯生物的4%多聚甲醛 PFA（GBCBIO-G0528）固定液广泛用于免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学（ICC)实验中的组织和细胞的固定，可避免直接接触有剧毒的多聚甲醛粉末。http://www.genebase.cn/Product/G0528.html
（2）脱水透明 （低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，组织块小的可以缩短脱水时间）
③ 70%乙醇，30-60 min（可 4℃过夜）
⑥ 100%乙醇，30 min （不要随意增加脱水时间，防止脱水过度）
⑧ 二甲苯 透明，10 min × 2 次 (10 min 时更换一次新鲜二甲苯，用二甲苯置换组织中的乙醇，组织会变得透明化。如果前面脱水不充分，二甲苯会变浑浊。)
◆ 注意：脱水时，把组织块放中带盖子的玻璃瓶中，在摇床上轻轻摇动，混合液体促进脱水；拧紧盖子，防止乙醇吸收空气中的水分。
◆ 梯度酒精可重复使用，按 1ml 乙醇溶液处理一个组织计算，配制 100ml 50%乙醇就可以处理 100 个组织，在试剂瓶上贴标签，画正字做标记，重复使用到差不多次数时就该换新的酒精溶液了。
◆ 1mm 的组织块二甲苯透明后会玻璃化；直径大些的组织块，二甲苯透明后，边缘玻璃化，中间雾蒙蒙时就已经算透明完成了，如果持续在二甲苯中待着，组织会变脆，切片时就容易切碎。二甲苯是挥发性液体，强致癌，需要戴口罩，在通风橱中操作。
◆ 原理：石蜡中 56℃时可以保持液体状态，把组织放入液体石蜡，让石蜡慢慢渗透进组织间隙；当温度降下来，石蜡凝固， 组织就能在石蜡的支撑下变硬，从而能被切成薄薄的切片，并保持原本的细胞结构。
① 石蜡，56℃，2h（省掉了二甲苯和石蜡 1：1，因为高温下二甲苯会让组织更容易变脆）
② 石蜡，56℃，2h （浸蜡 2h 后换一道新鲜蜡再浸一次，消除二甲苯的影响）
③ 制作包埋块 。使用新鲜化开的头道蜡，把蜡在 56℃融化后搅匀，用玻璃吸管将液体蜡加满金属托（如下图，中），再把浸泡在液体蜡中的组织块放入金属托，用预热的金属镊子调整组织块的切面，盖上塑料盖（作为切片时的样品托），补加蜡液淹没塑料盖，使塑料盖和组织切片形成一个整体（方便样品托要固定在切片机上）。包埋的组织块放室温，自然冷却凝固。为方便脱模，可以放入-20℃冻一会儿（冻久了蜡块容易裂）。
① 修块。修出一个组织块在中心的正方形或长方形的切面，四个角尽量是直角，这样切出来的切片正，不容易打卷。
② 切片：将蜡块固定在切片机上，切成薄片（5-8um）。切到组织部分时，稍微放慢进刀速度，切好的蜡片会形成一条连续的蜡带，切到一定长度就轻轻转移到旁边准备好的托盘里（托盘里铺一层黑色的衬底，有种黑色的塑料袋，上面有很多突起，可以很好的隔开蜡片，免得蜡片完全贴中塑料袋上）。
③ 展片和贴片：切下的薄片往往皱折，要将之轻轻漂浮在 37℃-42℃热水中 充分展开。转移进托盘的蜡带，可以 2 个组织一组，用手术刀分割一下，然后用镊子轻轻夹到 40℃水浴中展片和贴片，贴片时，载玻片在蜡片旁边竖着插进水里，再竖着提起来，蜡片就能贴在载玻片上。
④ 充分干燥：贴片后的载玻片先斜靠着晾干，利用重力赶走蜡片和载玻片之间的水，再收到片盒里，放到 37℃ 恒温箱烤片 3 天。
① 脱蜡：60 ℃ 烤 1h （切片上的蜡液融化） → 二甲苯 5 min → 二甲苯 5 min；
◆ 切片分别在二甲苯中 2 次以脱掉组织中的石蜡，使组织恢复到固定后的正常状态暴露出抗原以方便与一抗结合。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。脱蜡的效果主要是取决于切片的厚度、二甲苯的温度、脱蜡时间，或移入恒温箱加热脱蜡。
② 水化：梯度酒精各 5 分钟（高浓度到低浓度）。无水乙醇 5 min → 无水乙醇 5 min → 95%乙醇 5 min → 85%乙醇 5 min →75%乙醇 5 min → 50%乙醇 5 min；
◆ 水化的目的是洗去溶解的石蜡和二甲苯。二甲苯属于非水溶液的有机溶剂，进入组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，需要通过梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替换出来，使标本切片从无水状态顺利进入染色液中进行染色反应。
◆ 抗原修复是指暴露抗原被封闭或隐藏的表位，恢复其原有的空间状态，提高抗原阳性检出率的过程。由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
① 非加热修复：酶消化。胰蛋白酶（修复能力较弱，主要用于细胞内抗原的修复，使用 0.1%氯化钙（pH 7.6）制成 0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片 15-30 分钟，晾片应当适当延长时间）、胃蛋白酶（修复能力较强，可用于细胞间抗原的修复）、链霉蛋白酶、蛋白酶 K、皂素。总的来说，非加热修复能力较弱，一些位于细胞间质的抗原可以用酶消化法。
② 加热修复（3 选 1）：更推荐加热的修复方式，效果好，且稳定。
◆ 煮沸修复（加热修复中效果最弱）：电磁炉煮沸修复液 → 放入切片→ 持续沸腾 15-20 min，自然冷却 。石蜡切片脱蜡至水后，一片片放在耐高温的片夹上，放入盛有修复液的容器（如盛有足够柠檬酸修复液的玻璃烧杯），并将容器放入装满水的电锅里加热煮沸，从沸腾开始计时 15-20min，切断电源，室温冷却，PBS 洗，之后就可以进行免疫组化染色。
◆ 微波修复：微波炉煮沸修复液→ 放入切片→ 高火 5 min，冷却 10 min，重复 2-3 次，自然冷却 。微波炉加热煮沸柠檬酸修复液（耐高温的玻璃烧杯盛放修复液），沸腾时，将脱蜡至水的切片放在有机玻璃架上，放入修复液中（也有专用于微波修复的塑料盒，其中装柠檬酸修复液，把切片垂直插在盒中） 。按上述步骤加热修复后（有的抗体不好做，做 3 次加热重复可能会有改善），室温自然冷却，冷却过程中不要把切片从缓冲液中取出。修复完成后，PBS 洗 3 次，再进行后续的免疫组化染色。
◆ 高压修复：高压锅煮沸修复液→ 放入切片→ 高压锅开始喷气时计时 1-2 min，冷水冲淋冷却 。切片脱蜡至水后，使用高压锅加热沸腾修复液，将切片放在金属架上，放入沸腾的修复液中（尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆的损伤），高压锅开始喷气时计时 1-2min，关闭加热源，用冷水冲淋高压锅至室温，取下气阀，打开锅盖，取出切片，PBS 洗 3 次，再进行后续的免疫组化染色。
◆ 常用的修复方法从强到弱一般分为三种：高压加热修复、微波修复、胰酶修复。其中高压加热修复这一方法简便易操作，效果也更好。有的抗原用一种修复方法可能达不到理想效果，可以考虑酶消化法和高温修复法联用。
捷倍斯生物生产的 0.01M柠檬酸抗原修复液（GBCBIO-G7224）是一种常用的抗原修复液，可以用于石蜡切片、冰冻切片等样品使用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后的抗原修复。http://www.genebase.cn/Search/index.asp?q=G7224
3.3 封闭与抗体孵育
（1）灭活内源性过氧化物酶（上抗体之前选做的步骤）：3% H2O2（1ml 30%双氧水 + 9ml 甲醇，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织） ，室温孵育切片 10 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。
◆ 在传统的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC 法）和链霉亲和素-过氧化物酶法（SP 法）中，免疫组化反应容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活和封闭。
捷倍斯生物生产的 内源性过氧化物酶封闭液（GBCBIO-P7250）主要用于免疫组化(IHC)、免疫细胞化学染色(ICC)以及原位杂交(ISH)时组织或细胞内源性过氧化物酶的封闭。http://www.genebase.cn/Product/P7250-50ml.html
（2）封闭：10%羊血清，湿盒中室温 1h 或 4 ℃ 过夜。（与免疫荧光技术一样，使用 10%与第二抗体同种属的正常血清进行封闭，是为了防止一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性。）
（3）一抗孵育：去封闭剂，阻水笔画框将组织片框起来，每个组织上滴加 50ul 抗体，湿盒中 4 ℃ 过夜后，第二天 37 ℃ 1h。吸去一抗，PBS 洗 4 次，每次 5min。
◆ 不同的一抗浓度根据抗体说明书而定，孵育时间和温度等对染色结果往往有着较大的影响。在 4℃下，反应缓慢，背景较浅，推荐使用。
◆ PBS 洗涤是为了去除未反应的抗体和其他杂物，以减少非特异性反应引起的背景着色和杂物污染，因此应该充分洗涤，特别是一抗孵育后。一般使用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
（4）二抗孵育：加二抗，每个组织上滴加 50ul 抗体，湿盒中 37 ℃ 孵育 30min。吸去二抗，PBS 洗 8-12 次，每次 5min（尽量洗掉非特异的结合）。
（1）显色：新鲜配制 DAB 显色液（现配现用），每个组织滴加 50ul，显微镜下控制显色，只上了二抗没上一抗的对照没有出现棕色，而目的组织颜色反应明显时，将片子插到 PBS 里终止显色。
◆ DAB 显色液（3,3’-二氨基联苯胺）终产物为棕黄色或棕褐色，为免疫组化最常见的的显色液。DAB 显色的棕黄色色原稳定性好，不溶于有机溶剂，可长期保存而不褪色。背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由 DAB 孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。
捷倍斯生物生产的DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（GBCBIO-G3433）使用改良配方，AB液等体积混合即可，可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于 Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测，同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。http://www.genebase.cn/Product/G3433.html
◆ DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就立即出现很深的棕褐色，这可能说明一抗浓度过高，需要适当下调抗体浓度；若很短时间就出现深背景，有可能非特异性蛋白封闭不全，需要延长封闭时间；DAB 显色时间很长（如超过 10 分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。
（2）苏木素复染：显色完毕的片子放入苏木素染液（染细胞核）室温染色（不同牌子的苏木素染色时间不同，见说明书）后自来水冲洗 20-30min，显微镜下随时观察显色情况（够蓝就可以终止了）。
捷倍斯生物生产的苏木素染色液（GBCBIO-G4922）综合了多种经典的苏木素染色方法，例如Harris法、Mayer法等，简化了操作步骤，缩短了操作时间，并且染色液内不使用汞、甲醇等有毒试剂。
http://www.genebase.cn/Product/G4923.html
（3）脱水：95%乙醇 2-3s → 95%乙醇 2-3s → 100%乙醇 5 min → 二甲苯 : 无水乙醇 1:1 5min → 二甲苯 2min → 二甲苯 2 min。
捷倍斯生物生产的甘油明胶封片液（GBCBIO-G3025）是一种参考经典的Kaiser方法配制的水性封片液，但经过改良，不再含剧毒苯酚，可以用于常规的各种切片、涂片等的封片。
http://www.genebase.cn/Product/G3025.html
封片技巧：（如图）把准备好的盖玻片正面朝上、反面朝下放着，用小吸管画一长条树胶，然后把染色完毕带有组织的载玻片正面朝下、反面朝上倒扣到盖玻片上。
封片技巧示意
图源自：https://www.51xxziyuan.com/53/9778.html
3.5 拍照
拍照前要注意把显微镜输出图片的格式调成 TIFF 格式，像素尽可能的高。
带标尺和不带标尺的照片都要拍摄（各拍一套，有时候软件自带的标尺不好看，作图时按带标尺的照片用 PS 给不带标尺的照片加标尺）
很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。如何正确地分析，得出理想的结果。
结果分析主要有两种方法：阳性着色细胞计数法和评分法。
前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；
后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
4.1 对照染色
没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。
4.2 定位
抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。
4.3 肉眼定量
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个视野。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。
4.4 图像分析软件
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析软件，图像分析软件类型很多。
Image J为例，一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了其界面非常简洁，如下图所示：
现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？
首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。
步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。
有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。
步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。
然后，就可以正式开始分析了。
步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。
最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。
1.科研星球《免疫组化实验操作》
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