1、WB实验最重要的是什么？
答：安全！安全！安全！爱护身体，保护自己。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定戴手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必须加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；
b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。
4、我的目的条带很弱，怎么加强？
答：最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。
5、胶片背景很脏，有什么解决方法？
答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。
6、目标带是空白，周围有背景，是为什么？
答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。
7、我的胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
b) ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。
c) ECL底物没覆盖到相应位置；
d) 二抗时间过期，或平时使用不当导致二抗失活。
8、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必须加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；
b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。
10、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？
答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。
b)蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量。
11、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？
答：可能是：
a)样品浓度过低；
b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为我们提供简单的指示作用。)
12、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。
13、做组织样品的WB的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
14、有什么方法可以提高上样量？
答：a)可以浓缩样品；或增大上样体积来增大上样量；
b)用5X的上样缓冲液来稀释变性。
15、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜，不要整张膜孵育，耗费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议，仅供参考)。
16、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
答：没有问题，就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点电泳液保持湿度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有问题，你可以重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺；能够替换的试剂，尽量换一下，选用进口试剂。
17、我用的是可视Marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。Marker是新买的。
答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必须加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。
18、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？
答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：
a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
19、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好好像不是很好，为什么？
答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过头的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。
20、WB中抗体的可以重复应用吗？
答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
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