完整的Western实验过程比较长，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也时有发生，最常见的一种就数显色后背景高了，背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更别说进行数据分析了。显色背景高的原因有很多: 封闭问题，洗脱问题，一抗二抗问题等。其中最显著的就是封闭问题。
Western 实验中，PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时将蛋白吸附。封闭的目的是就将PVDF膜上无蛋白的部分空隙填满，以免孵抗体的时候，一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。封闭这一步还是比较关键的，封闭不好容易造成高背景。
最常用的封闭也就是脱脂奶粉和牛血清白蛋白（BSA），当然还有 血清 ，鱼皮明胶， 聚乙烯吡咯烷酮，封闭液 这些封闭稀释液对实验有什么影响？为了让大家更方便的选择适合实验的封闭液，这里给大家介绍6种不同的封闭液，以及它们的优缺点。
最便宜而且最好买的封闭剂就属脱脂奶粉了。通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。但值得注意的是，脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。
牛血清白蛋白是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，是除了脱脂奶粉之外，非常常用的封闭剂。通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。但大家也可 以根据自己实验的需要来改变浓度，因为价格比较高，所以很多研究人员都是用尽可能低而有效的浓度。虽然BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，但是提纯过程中有 可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号 。
血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。
明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。
PVP 是传统封闭液的非蛋白质性质的替代品。虽然早在1993年就有文献发表，在封闭技术上却是很新的产品。PVP是一种水溶性多聚物，可以很快和硝酸纤维素和PVDF膜结合。通常使用的浓度在0.5-2%（w/v），而且通常会和其他封闭剂一起使用。PVP 在用于检测较小目标蛋白的时候非常有效。
商品化封闭液通常含有提纯过的蛋白，用这个封闭液的好处就是你可以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封闭液中难以避免的成分。当然，价格也就更贵。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题，而且封闭时间很快。
相信大家现在对各种封闭液都有了更全面的了解。总的来说，封闭液的选择基于三样事情：抗体、目标蛋白和检测系统。但是要想找到适合自己目标蛋白的封闭液，并不简单。除了排出一些很明显不合适的，剩下的就需要多花点时间尝试不同种类、不同浓度的封闭液，才能找到最适合的。
封闭的流程是怎么样的？
01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；
02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。
封闭有哪些常见的问题？
奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。
图2 条带上有黑色斑点
封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。
图3 条带背景高
条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。
图4 条带信号弱
货号
|
试剂名称-(GBCBIO) |
| 232100-100g |
脱脂奶粉|Skim milk |
| 0332-100g |
牛血清白蛋白|BSA |
| 9764-100g |
明胶 | Gelatin | 9000-700-2 |
| 0507-25g |
聚乙烯吡咯烷酮4万 | PVP 40,000 | 9003-39-8 |
| G7205-500ml |
Western 快速封闭液 FastBlockTM Blocking Buffer |
| G7105 |
Western封闭液|Western Blocking Buffer |
参考文献：
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