免疫组化最常用的4种结果分析方法，你都做对了么？

免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)技术，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。广泛的应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。

1、在60°烤箱烤片30~60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子最好是找专业培训郭的人员切片，片子的厚薄均匀，切片的完整，无褶无刀痕。

2、脱蜡水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自来水洗一下，但不要直接对着切片冲洗。

3、抗原修复，小编用的是高压热修复，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液，一定要全部浸泡切片，等高压锅冒气后5min结束，自然冷却，温度剧降可能引起脱片哦。3%H202避光浸泡15min。

4、用免疫组化油笔围绕组织画圈，接下来就能看见它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS会被锁在画的圈中，不会流干，保证不干片。

结果分析主要有两种方法：阳性着色细胞计数法和评分法。

前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；

后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

1.对照染色

2.定位

3.肉眼定量

4.图像分析软件

首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。

步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。

步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。

有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。

步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。

然后，就可以正式开始分析了。

步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。

如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。

最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。