一、细胞迁移/侵袭简介
细胞迁移（Cell Migration）也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。在胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、肿瘤转移等多个过程中都涉及到细胞迁移。由于转移性疾病是导致癌症死亡的关键因素，因此了解细胞迁移机制对于癌症研究至关重要。
肿瘤细胞侵袭模型（Novikov et al., 2021）。
细胞侵袭（Cell Invasion）是细胞迁移的一种，与细胞迁移密不可分，是指细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，即入侵的细胞（如恶性肿瘤细胞）穿过胞外基质层（Extracellular Matrix，ECM）或基底膜基质层（BME）从一个区域侵入到另一个区域，在侵袭到新区域之前，ECM/BME被细胞内的蛋白酶降解。细胞侵袭常发生于伤口修复、血管形成和炎症反应以及组织的异常浸润、肿瘤细胞转移等过程中。因此，研究其中的机制对多种生理/病理过程都有着重要的意义。而肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。
二、肿瘤转移的几个关键步骤
肿瘤转移是癌症进展中一个复杂而关键的过程，在此过程中癌细胞从原发肿瘤扩散到身体的其他部位，形成继发性肿瘤或转移瘤，这一系列过程统称为侵袭-转移级联。原发肿瘤的转移过程可分为几个关键步骤(图2)：
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局部侵袭(Local Invasion)附近细胞的细胞外基质(ECM)和基质细胞层。转移的第一步是肿瘤细胞对局部附近组织的侵袭。原发肿瘤细胞外蛋白酶如机制金属蛋白酶(MMP)的分泌，可降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，从而使肿瘤细胞穿透周围组织进入循环系统。 -
内渗(Intravasation)进入淋巴管或血管腔。局部侵袭后，部分癌细胞进入附近的血管或淋巴管。 这个过程称为内渗。这些血管和淋巴管为癌细胞提供了一种传播到体内远处部位的途径。 -
生存于循环系统(Survival in the circulation)进入血液或淋巴系统的癌细胞面临着重大挑战，包括剪切力、免疫监视和失巢凋亡(细胞从ECM脱离时发生的一种细胞死亡)。为了在循环系统中生存，癌细胞可能会形成聚集体或团块并逃避免疫检测，这些细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells(CTCs))。 -
到达解剖学上的远端器官组织。一旦肿瘤细胞进入循环，这些细胞就会被携带到全身。 最终，它们可能会滞留在毛细血管床上，其中较小的血管限制了它们的运动。 这种停滞是由于癌细胞上的粘附分子与次要部位血管内皮细胞之间的相互作用所致。 -
外渗(Extravasation)入远端正常器官组织细胞。癌细胞必须离开血流或淋巴管才能形成继发性肿瘤。 癌细胞的粘附特性发生变化，通过穿透将血管腔与间质微环境分离的内皮细胞和周细胞层，从血管腔内进入组织，这一过程被称为外渗。 -
在新环境中的最初生存和微转移。一旦癌细胞成功外渗，它们就会面临在其在远端组织微环境中生存的挑战。这些包括逃避免疫反应、适应新的微环境以及增殖形成继发性肿瘤。 继发部位的微环境可能与原发肿瘤不同，这些微环境的差异可能包括基质细胞的类型、ECM成分、可用的生长因子和细胞因子，甚至是组织本身的微结构。癌细胞需要适应这些变化才能生存和生长。 -
转移性定植(Metastatic Colonization)即重新启动增殖程序并形成转移灶。经历过这七个步骤后原发性肿瘤可以产生宏观的、临床可检测到的肿瘤生长，通常称为转移定植。为了促进其生长，转移性癌细胞通常通过称为血管生成的过程诱导新血管的形成。 这确保了营养物质和氧气的持续供应，以支持继发性肿瘤的发展。继发性肿瘤可以继续侵入周围组织，并可能通过血流或淋巴系统进一步扩散。 这个过程会导致体内不同部位形成多个继发性肿瘤[1-3]。
检测细胞迁移能力最常见的方法是细胞划痕实验和Transwell小室检测，两者的区别在于细胞划痕简单经济，模拟单层细胞在2D平面的迁移；而Transwell成本较高，模拟细胞在3D空间的迁移。另外，Transwell也是检测细胞侵袭能力最常用的手段。
三、细胞划痕实验
实验原理简介：
当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移过程。
图3 划痕实验示意图（Hulkower et al., 2011）。
培养板划线—铺板—细胞划线—清洗—细胞培养观察—结果分析
2、实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同类型细胞要观察细胞贴壁率等，确定实验时细胞种板数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。
3、减少细胞增殖对实验结果的影响，应选择加入无血清或血清浓度低（≤2%）的培养基进行细胞培养。
细胞划痕的优点:
四.Transwell小室检测实验
它通常用于研究细胞对各种刺激(如生长因子、趋化因子或细胞外基质成分)的迁移、趋化性和侵袭[4]。Transwell实验对于评估细胞通过多孔屏障迁移或侵袭的能力特别有用，多孔屏障模拟细胞必须穿过体内组织的生理条件。Transwell实验涉及Transwell小室(插入物)和孔板，它们是一种由分隔两个隔室的渗透膜组成的装置。 通常，顶部室充满细胞，而底部室包含化学引诱剂或诱导细胞迁移的物质。多孔膜允许细胞通过膜上的小孔从顶部室迁移到底部室。
Transwell实验根据是否在小室内添加基质胶分为两种类型(图4)：
Transwell细胞迁移操作步骤：
细胞培养与处理—Transwell小室准备—制备细胞悬液—接种细胞至上方小室—细胞固定—细胞染色—封片—细胞观察计数
Transwell实验注意事项：
6. 小室的放置过程经常有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，因此需特别留心。一旦出现气泡，需将小室提起或用枪头去除，去除气泡后重新放置。
9. 拍照前需适当晾干小室，水分会影响镜下视野。
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